生体を模倣したin vitro毒性評価を実現する魚類肝細胞スフェロイドの高機能化

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K19979
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 本田 晴香 (古賀晴香) 秋田大学, 理工学研究科, 助教 (90756983)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 魚類肝細胞 / スフェロイド / 細胞外マトリクス

Outline of Annual Research Achievements

魚類肝細胞は、in vitroにおける環境評価試験や環境毒性試験での重要な細胞源である。これまで魚類肝細胞を用いたセルベースアッセイでは、細胞をフラスコやシャーレ底面に接着、伸展させる単層培養法が利用されてきた。単層培養法では、生体内の細胞が元来有する構造や機能を数日で失ってしまうため、長期に渡る試験が困難である。一方、細胞を三次元的に集合・凝集させるスフェロイド培養は、単層培養よりも生体に近い機能を模倣できることが数多く報告されている。
申請者は、スフェロイド形成時に細胞外マトリクス（ECM）を添加することで、魚類肝細胞スフェロイドのさらなる機能発現の向上を発想した。本研究では、「スフェロイド化＋ECM成分添加」の相乗効果により、生体内の細胞の立体構造や機能を模倣し、それを少なくとも1か月間維持可能な、魚類肝細胞スフェロイド培養方法の確立を目指す。
2020年度（令和2年度）は、魚類肝細胞株であるPLHC-1細胞のスフェロイド化を行い、スフェロイドの形態と構造、薬物代謝活性、およびタンパク質合成能の3点から、スフェロイドの特性解析を行った。PLHC-1細胞は、4～5日間かけて自己集合し、スフェロイドを形成した。肝細胞で代謝され、微小胆管に輸送されるCDFDAを培養21日目のスフェロイドに暴露し、蛍光観察を行った。その結果、スフェロイド内部に胆管様構造を形成している可能性が示唆された。また、薬物代謝活性（EROD活性）を評価したところ、スフェロイド培養では少なくとも21日間、高いEROD活性を維持した。さらに、Albumin Blue Fluorescent Assay Kitにより、培地中に放出されたアルブミンを測定したところ、単層培養よりもスフェロイド培養の方が、高いアルブミン合成能を維持している可能性を見出した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請者は、2020年度（令和2年度）4月より熊本高専から秋田大学へ異動した。そのため、研究の遂行に必要な実験機器の運搬、設置、整備が必要な状況であり、研究環境が変化した。特に2020年度（令和2年度）7月の九州豪雨、および新型コロナウイルス感染拡大の影響によって上記の対応に時間を要したため、細胞外マトリクス（ECM）の添加によるスフェロイド形成の予備検討を十分に行うことができなかった。そのため、「やや遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

2021年度（令和3年度）は、細胞外マトリクス（ECM）添加によるスフェロイド特性の変化を評価し、スフェロイドの機能向上に適したECM添加条件を見出す。評価する項目は2020年度（令和2年度）と同様、スフェロイドの形態と構造、薬物代謝活性、タンパク質合成能を予定している。現在、コラーゲン、ゼラチン、および人工コラーゲンペプチド溶液を添加したスフェロイド形成の予備実験を行っており、ECMの種類、濃度など、培養系へのECM添加の条件を検討する。

Causes of Carryover

申請者は、2020年度（令和2年度）4月より熊本高専から秋田大学へ異動した。そのため、研究環境の変化（実験機器の設置状況の違いなど）によって、当初の計画とのずれ、および研究の遂行にやや遅れが生じた。また、研究環境の整備を優先したこと、および新型コロナウイルス感染拡大の影響もあり、出張や学会参加が困難となった。これらの理由により、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、遅れている分の実験を効率的に進めるため、主に実験用消耗品に充てる予定である。