2020 Fiscal Year Research-status Report

ビフィズス菌の糖代謝機構を利用した機能性細胞外小胞の創製とがん免疫療法への応用

Research Project

Project/Area Number	20K20205
Research Institution	Kyoto Pharmaceutical University
Principal Investigator	森下将輝京都薬科大学, 薬学部, 助教 (10811747)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	プロバイオティクス / 細胞外小胞 / 糖代謝 / がん免疫療法
Outline of Annual Research Achievements	近年、有用微生物 (プロバイオティクス) が分泌する細胞外小胞が新たに発見された。この細胞外小胞には分泌するプロバイオティクスと同様に有益な生理活性が備わっていることから、細胞外小胞を利用した新たな疾患治療法の開発が期待されている。その実現には既存の薬物や機能性素子を細胞外小胞に搭載して機能改変を図る必要があるものの、従来の方法では機能改変後に細胞外小胞の生理活性が損なわれる懸念があった。本研究ではプロバイオティクス由来細胞外小胞の活性保持と機能付与を両立できる技術を開発し、難治性がんに対するがん免疫療法の構築を目指す。当該年度は、プロバイオティクスの1種であるビフィズス菌の糖代謝機構を利用した機能改変を試みた。ビフィズス菌にアジド糖を取り込ませた後、培養液中の細胞外小胞を超遠心操作により回収した。この細胞外小胞に対し、アジド基に高い反応性を持つアルキン含有の蛍光物質を添加し、蛍光顕微鏡で細胞外小胞を観察した。その結果、細胞外小胞の回収には成功したものの、アルキン修飾蛍光物質と反応後に観察された蛍光強度は微弱であった。そこで、ビフィズス菌に対するアジド糖の添加量を変えることで、分泌された細胞外小胞上のアジド基発現量の最適化を図った。さらに、アルキン修飾蛍光物質との反応時にはアジド－アルキン反応を触媒する銅イオンの添加も試みた。しかしながら、アジド糖の添加量の増大や触媒の添加を試みても細胞外小胞の蛍光強度の改善は見られなかった。以上の結果より、ビフィズス菌へのアジド糖の取り込みを介して細胞外小胞へ十分量のアジド基を導入するには、前段階である菌体へのアジド基の導入過程の最適化が必要であると考えた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究課題の遂行には、糖代謝機構を利用したビフィズス菌への機能付与のみならず分泌される細胞外小胞への機能付与も必要不可欠である。現在までに、アジド基含有糖を取り込んだビフィズス菌は細胞外小胞を分泌することを確認しているが、得られた細胞外小胞に発現するアジド基の量は十分ではなかった。本年度は糖代謝機構を介して細胞外小胞にアジド基を導入し、これがアルキンに対する反応性を示すことを確認する予定であったため当初の計画よりもやや遅れている。
Strategy for Future Research Activity	今後は、ビフィズス菌由来細胞外小胞に十分量のアジド基を導入可能な条件を確立し、次いでアジド－アルキン反応を利用した細胞外小胞への機能付与を行う。これを実現するために、アジド糖添加時のビフィズス菌の培養条件を最適化する。すなわち、ビフィズス菌の増殖度合いの指標である濁度を調節することで、アジド糖がビフィズス菌に最大限効率的に取り込まれる条件を確立する。また、ビフィズス菌および細胞外小胞が発現する糖鎖は多岐に及ぶことから、使用するアジド糖の変更も検討する。一連の条件検討によりアジド基導入ビフィズス菌由来細胞外小胞を回収した後、がん抗原および抗原提示細胞指向性を付与する。ウェスタンブロッティング法で目的分子の付与を確認した後、細胞外小胞の抗原提示能増強活性も合わせて評価する。
Causes of Carryover	当初の計画では、当該年度はアジド糖を取り込んだビフィズス菌からの細胞外小胞の回収、および細胞外小胞がアルキンに対する反応性を示すことを確認する予定であった。この計画に対してビフィズス菌から細胞外小胞を回収することには成功したが、アジド糖の添加条件の最適化に時間を要したため細胞外小胞へのアルキンの反応性の確認には至らなかった。これらの要因により次年度使用となる助成金が発生した次第である。よって翌年度はビフィズス菌由来細胞外小胞に十分量のアジド基を導入可能な条件の確立を目的とした検討を重点的に行い、次いでアジド－アルキン反応を利用した細胞外小胞への機能付与を行う予定である。従って翌年度は当初よりも多くの物品費を支出する計画であることから、関連経費の執行に際しては当該助成金を充てる予定である。