2021 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集に伴い意図せず編集されうる塩基配列条件の解明
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20K20255
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
山下 拓真 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 研究員 (10866528)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / オフターゲット変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在、幅広い遺伝性疾患を根治可能な遺伝子治療として、CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集技術の応用が期待されている。しかしながら、標的配列と類似した配列を持つ目的外の部位での変異 (オフターゲット変異)が安全性の観点から問題となっている。このような背景を受けて、本研究では、オフターゲット変異を起こしうる塩基配列条件を明らかにすることを目的として研究を行う。このために、標的配列をあえて特異性の低い配列に設定することで、多数のオフターゲット変異候補配列を同時に評価する。
初年度には、ヒトゲノム中に完全相補となる配列は1つであるが、1塩基以上のミスマッチがある配列が多数存在する21塩基を標的とするガイドRNAを配列検索ソフトウェアであるGGGenomeを用いて複数種類設計した。設計したガイドRNAをそれぞれ調製し、Staphylococcus aureus 由来 Cas9 (SaCas9) との複合体が標的配列を持つDNA断片を切断する効率を評価することで、標的配列で十分な切断活性が得られるガイドRNAを選定した。その後、ヒト1倍体細胞であるHAP1細胞から抽出したゲノムDNAに対して、選定したガイドRNAとSaCas9の複合体を作用させた。
最終年度には、特異性の低いガイドRNAとSaCas9の複合体を用いてHAP1細胞のゲノムを切断したサンプルを用い、ハイスループットシークエンス解析の結果を解析した。その結果、SaCas9により切断された配列の多くは数塩基までのミスマッチを含む配列であり、Cas9が認識するPAM配列が典型的な配列(5’-NNGRR-3’)でない場合にも切断されうることが示された。
本研究の結果から、ゲノム編集に伴うオフターゲット変異候補部位の予測評価の際には、ガイドRNAとの相補性を指標に、非典型的なPAM配列も含めて評価する必要があることが示された。
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