2017 Fiscal Year Annual Research Report
Discovery of non-canonical mitophagy regulated by Mieap and its role in mitochondrial quality control
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17H06267
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
荒川 博文 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (70313088)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / リソソーム / オートファジー / 蛋白質分解 / p53 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題においてはp53誘導性タンパク質Mieapによって制御される非古典的マイトファジー（MALM及びMIV）の誘導メカニズムに関する詳細な解析とその生理的意義に関する研究を進めている。そのために【１】MALM誘導時のミトコンドリア内リソソームの存在を証明・【２】MALM誘導の分子メカニズムの解明・【３】MIV誘導の分子メカニズムの解明・【４】MALMとMIVの使い分けのメカニズムの解明、の4つを遂行する。今年度は、この中でMALMに関する【１】【２】及びMIVに関する【３】を主体に研究を進めた。
【１】MALM誘導時のミトコンドリア内リソソームの存在を証明：（１）電子顕微鏡による形態学的解析及び（２）プロテオーム解析による生化学的解析を進めた。（１）形態学的解析に関しては、細胞株に加えてマウス生体内ですでにMieapの特異的発現が確認されている肝臓・心臓を用いた免疫電子顕微鏡解析を行った。さらに（２）プロテオーム解析を行うにあたっては、従来のミトコンドリア単離法では困難であった細胞内の生理的なミトコンドリア形態・機能を保持したままの単離を試みた（柴田法）。
【２】MALM誘導の分子メカニズムの解明：（１）MALM誘導のための介在分子の探索と同定、（２）MALM誘導過程の可視化、の2点を試みた。
【３】MIV誘導の分子メカニズムの解明：（１）MIV誘導のための介在分子の探索と同定、（２）MIV誘導過程の可視化、の2点を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【１】MALM誘導時のミトコンドリア内リソソームの存在を証明：（１）電子顕微鏡による形態学的解析によって現在までにリソソーム様オルガネラ構造のミトコンドリア内存在は確認できていない。（２）プロテオーム解析による生化学的解析によってMALM誘導時のCathepsin-Dタンパク質及びLAMP1タンパク質のミトコンドリア内存在を確認した（従来法によるミトコンドリア単離）。従来のミトコンドリア単離法では困難であった細胞内の生理的なミトコンドリア形態・機能を保持したままの単離法（柴田法）は現在条件検討を行っている段階である。
【２】MALM誘導の分子メカニズムの解明：（１）MALM誘導のための介在分子の探索と同定のために抗Mieap抗体を用いた免疫沈降法と沈降物に対するプロテオミクス解析を行っている。現在までに既存の会合分子とは異なる新規会合分子の同定には至っていない。（２）MALM誘導過程の可視化を試みているが現在使用の共焦点顕微鏡の機種に関しては検出限界などの問題があり、新規共焦点顕微鏡及び超解像顕微鏡を使った解析の準備を進めている。
【３】MIV誘導の分子メカニズムの解明：（１）MIV誘導のための介在分子の探索と同定を試み、新規会合分子を数種類同定した。（２）MIV誘導過程の可視化に関しては【２】と同様に新規機種による解析の準備を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
【１】MALM誘導時のミトコンドリア内リソソームの存在を証明：引き続きこれまでと同様の（１）形態学的解析と（２）生化学的解析を進める。（１）に関してはマウス組織におけるMieap発現解析によって明らかとなっているMieap高発現組織を中心に免疫電子顕微鏡解析を行う。（２）に関しては柴田法の至適条件を決定した上で、より生理的な単離ミトコンドリアに対する解析を行う予定である。
【２】MALM誘導の分子メカニズムの解明：
【３】MIV誘導の分子メカニズムの解明：
引き続きこれまでと同様の（１）介在分子の同定と（２）MALM可視化を進める。（２）に関しては、Mieap・ミトコンドリア・リソソームの3つを同時に可視化することで、動的にMALM及びMIVの発生過程を解析する。そのための新規共焦点顕微鏡及び超解像度顕微鏡による解析を重点的に進めて行く。
【４】MALMとMIVの使い分けのメカニズムの解明：MLAMがMieap-beta、MIVがMieap-alphaによって制御されていることから、Mieap-alphaとMieap-betaの発現調節様式の違いを転写レベル・翻訳レベル・蛋白質安定性・蛋白質修飾などの観点から調べて行く。またMieap-alpha特異的及びMieap-beta特異的会合分子の探索・同定・機能解析を行っていく。
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Research Products
(12 results)
