2018 Fiscal Year Annual Research Report
Discovery of non-canonical mitophagy regulated by Mieap and its role in mitochondrial quality control
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17H06267
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
荒川 博文 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (70313088)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / リソソーム / オートファジー / p53 / タンパク質分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題においてはp53誘導性タンパク質Mieapによって制御される非古典的マイトファジー（MALM及びMIV）の誘導メカニズムに関する詳細な解析とその生理的意義に関する研究を進めている。そのために【１】MALM誘導時のミトコンドリア内リソソームの存在を証明、【２】MALM誘導の分子メカニズムの解明、【３】MIV誘導の分子メカニズムの解明、【４】MALMとMIVの使い分けのメカニズムの解明、の4つを遂行している。今年度は、【１】～【４】に関して、様々な蛍光タンパク質あるいは蛍光プローブを用いたライブセルイメージング解析を主体的に実験を進めた。
【１】【２】：p53及びMieapを正常型として保持している大腸がん細胞株と肺がん細胞株を用いて、放射線照射を行うことでMALMを誘導し、リソソームをLysotraker-red, Lysotracker-green, RFP-LAMP1, GFP-LAMP1で標識し、一方でミトコンドリアをMitotracker-red, Mitotracker-green, GFP-NIX, GFP-BNIP3, Apple-TOMで標識することで、リソソームとミトコンドリアの挙動に関して、生細胞可視化を試みた。
【３】【４】：同様に大腸がん細胞株と肺がん細胞株へGFP融合タンパク質として発現させた正常型Mieap及び様々なMieap変異体を用いてMIVの生細胞可視化実験を行った。
いずれの実験においてもMALMあるいはMIVの発生及び進展過程の生細胞可視化に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【１】MALM誘導時のミトコンドリア内リソソームの存在を証明：リソソーム及びミトコンドリアそれぞれに対する蛍光タンパク質あるいは蛍光プローブを用いたライブセイルイメージング解析によって、放射線照射を行ったp53及びMieapを正常型として保持している大腸がん細胞株と肺がん細胞株において、ミトコンドリア内に存在すると予測されるリソソームのシグナルを確認した。
【２】MALM誘導の分子メカニズムの解明：蛍光タンパク質あるいは蛍光プローブを用いたライブセイルイメージング解析によって、Mieapタンパク質のシグナルがミトコンドリア内へ検出された。
【３】MIV誘導の分子メカニズムの解明： 蛍光タンパク質あるいは蛍光プローブを用いたライブセイルイメージング解析によって、MIV形成においてはMieapタンパク質のcoiled-coil領域とC末領域が重要である事が推測された。
【４】MALMとMIVの使い分けのメカニズムの解明：GFP-Mieapのイメージング解析より、MALMとMIVの選択性においては、従来から明らかとなっているNIX及びBNIP3が重要である事が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
【１】～【４】：今年度の解析から、リソソームやミトコンドリア、Mieapタンパク質およびMieap関連タンパク質を、様々な蛍光タンパク質あるいは蛍光プローブとして可視化し、生細胞によって解析を行うことは、本研究課題のメカニズム解明に大きく貢献しうる解析法であることが示された。よって今後は、様々な蛍光タンパク質および蛍光プローブを用いたライブセルイメージング解析を主体的に行い、そこで得られた結果やそれら結果に基づく仮説の検証のために、電子顕微鏡解析、生化学的解析、免疫組織化学的解析、蛍光免疫染色解析などを行っていく方針とした。
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