2019 Fiscal Year Annual Research Report
非レトロRNAウイルス網羅解析技術による新しいRNAウイルス学の創出
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18H05368
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology |
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Principal Investigator |
布浦 拓郎 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海洋機能利用部門(生命理工学センター), センター長代理 (60359164)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高木 善弘 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 深海・地殻内生物圏研究分野, 主任技術研究員 (10399561)
浦山 俊一 筑波大学, 生命環境系, 助教 (50736220)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | RNAウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・RNAウイルスゲノムを網羅的に検出するFLDS法の適用拡大
令和元年度においては前年度に引き続き、研究協力者の支援を受けつつ、植物組織、動物組織、糞便試料、海洋や陸域由来の環境微生物群集等にFLDS法の適用し、未知系統群を含むRNAウイルスゲノム解析を実施した。これまでにアリや海綿、藻類からの新規RNAウイルスを検出した事例について報告した(Fukasawa et al. 2020, Urayama et al. 2020, Chiba et al. submitted)。また、全てのRNAウイルスが有すRNA-dependent RNA polymerase遺伝子が相同性検索において検出できないレベルの新規性のあるRNAウイルス配列を同定する手法について、研究協力者の支援を受けつつ、検討を進めた。更に、海外グループとの連携を通し、最終年度の主要課題としてきた得られたゲノム情報を含むRNAウイルスデータベースの構築について、前倒しで取り組んでいる。この他、高等動物組織への適用、FLDS法の高感度化に向けた手法改良を進め、またFLDS法のウイルス集団のマイクロダイバーシティー解析への適用を実施した（Kadoya et al. 2020）。
・機能遺伝子としての未知RNAウイルス配列のリソース化
令和元年度より、RNAウイルス遺伝子からの機能スクリーニングを行う為、システムのパン酵母をホストとした試験系の構築を開始した。FLDS法で得たRNAウイルス遺伝子断片（cDNAライブラリーに相当）を、ランダムに新たに作成した発現用シャトルベクターへ導入可能であることを確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・RNAウイルスゲノムを網羅的に検出するFLDS法の適用拡大
FLDS法の適用拡大は、植物組織、動物組織、糞便試料、海洋や陸域由来の環境微生物群集等順調に適応事例が増え、また、その利用可能性が実証できている。高等動物組織への適用においてのみ、組織中のdsRNAが相対的に低いことに起因すると考えられる適用の難しさが明らかになったが、現在進めているFLDS法の高感度化に向けた取組と、平成30年度に実施したdsRNA精製過程の見直し結果を組み合わせることで、この問題も解消出来る見込みである。さらに、得られた新規RNAウイルスゲノム配列のデータベース化についても、未知ウイルスゲノムの情報学的マイニング手法の検討と、国際連携を組み合わせることで、これまでにないRNAウイルスゲノムデータベースの構築に目処が立っている。この他、従来手法では、非常に手間が掛かっていたRNAウイルスゲノムのSNP解析であるが、FLDS法の適用により、非常に簡便に十分なカバー率で全ゲノム領域を対象とした解析が可能であることが、ロタウイルスをモデルとした研究により実証することが出来た（Kadoya et al. 2020）。全体的に順調に進捗している。
・機能遺伝子としての未知RNAウイルス配列のリソース化
令和元年度より開始したが、パン酵母をモデル系としてRNAウイルスゲノムを導入する手法の確立に目処がついている。パン酵母の発現用シャトルベクターへ環境中から取得したRNAウイルスゲノム断片を導入し、これまでに開始コドンを含む発現コンストラクトを有すこと、この読み枠にインフレームでウイルス遺伝子が搭載されたものも存在することが確認できており、当初の目標をほぼ達成している。令和二年度に本格的に形質転換を指標とした機能スクリーニングを実施予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
・RNAウイルスゲノムを網羅的に検出するFLDS法の適用拡大とデータベース構築
令和二年度前半は、前年度後半に実施したFLDS法の高感度化に関する試みと共に、研究協力者の協力を得つつ、未知系統群ウイルスゲノム検出手法を確立する。更に、年度後半にかけ、これまでに多様な試料から得たRNAウイルスゲノムを含むデータベースを国際協力により、構築を進める。
・機能遺伝子としての未知RNAウイルス配列のリソース化
最終年度はRNAウイルス遺伝子断片を搭載したシャトルベクターライブラリーをパン酵母に導入し、ストレス条件下で選択培養することで、耐性化に寄与するRNAウイルス遺伝子の同定を目指す。この際、RNAウイルス遺伝子を搭載したシャトルベクターライブラリーのサイズやシャトルベクターの導入効率がスクリーニングの成否を決める重要な要因であり、これらの課題について検討を進めていく。
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