2020 Fiscal Year Research-status Report
生体硬組織形成の初期過程解明に向けたナノレベル多相的解析
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20K20476
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村上 伸也 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (70239490)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩山 智明 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (80757865)
小椋 俊彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 上級主任研究員 (70371028)
柏木 陽一郎 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (20598396)
山下 元三 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (90524984)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 石灰化過程 / リン酸カルシウム / 骨芽細胞 / 歯根膜細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、大阪大学グループと産業技術総合研究所（産総研）グループの2グループによる研究班を編成し、石灰化の初期過程の解明を目指す。本年度は以下の研究を実施した。
大阪大学・村上グループは、昨年度に引き続き、ゲノム編集技術を用いてノックアウト骨芽細胞クローンを作製した。基質小胞形成に関与する遺伝子のみならず、本年度は我々の研究室にて侵襲性歯周炎患者のゲノムワイド関連解析により同定された侵襲性歯周炎に関連する遺伝子群のノックアウト細胞を作製した。すべての細胞はシングルセルソーティングによりクローン化した。これらの細胞の石灰化過程の解析においては、産総研・小椋グループが開発した生きたまま細胞をナノレベル観察可能な、誘電率顕微鏡を用いた。改良したアルミサンプルホルダーを用いて、作製したノックアウト細胞の石灰化過程を観察し、野生型細胞で多数の粒子として観察される基質小胞について、その分布やサイズを検討した。興味深いことに、1遺伝子のノックアウト細胞では、基質小胞が筋状に集積する様子が観察され、基質小胞が成熟される過程で形成されたオルガネラにとどまっている可能性が示唆された。
さらに成分分析法を応用した新規生細胞イメージング法の開発を目指し、オルガネラやコラーゲン等の細胞外基質に金属結合タンパク質を融合させたタンパク質を産生する細胞を、Tild-CRISPR法を用いて作製した。タグの発現をELISA法や免疫染色にて確認済みであり、今後同細胞の誘電率顕微鏡観察を行う。以上の成果の一部を国内外の学会で発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りに、複数の細胞のノックアウト細胞クローン、ノックイン細胞クローンの樹立・解析、誘電率顕微鏡の改良が達成された。
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| Strategy for Future Research Activity |
改良した誘電率顕微鏡を用いて、上述の細胞クローンを溶液中で生きたまま解像度の高い撮像を行う。また、より早い放出過程の変化を観察できるよう、撮像時間の高速化を進めることや、蛍光観察を同時に行えるよう誘電率顕微鏡内に光学顕微鏡を設置すること、等のさらなる改良を引き続き検討する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の流行に起因して、研究計画の一部見直しが必要であったため。次年度に同計画を実施することにより、当初計画した通りの研究実施が可能である。
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