2021 Fiscal Year Research-status Report
Dissection of the molecular basis of membrane vesicle biogenesis and construction of an extracellular platform for substance production by using a hyper-vesiculating bacterium
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20K20570
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 教授 (70243087)
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2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞外膜小胞 / タンパク質輸送 / タンパク質分泌 / 表層多糖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【細胞外膜小胞形成を担う分子基盤の解明】細胞外膜小胞高生産性細菌 Shewanella vesiculosa HM13 の膜小胞生産に関与する因子を、トランスポゾンランダム変異導入によって探索した。変異株ライブラリーの各変異株の膜小胞生産性を、曲率認識ペプチドを用いたハイスループットスクリーニングによって評価し、膜小胞生産性が変化した株を選抜した。さらに、選抜された株の培養上清をナノ粒子トラッキング解析に供して膜小胞生産性を定量した。その結果、2,392 株の変異株から、7 株の膜小胞高生産変異株と 3 株の膜小胞低生産変異株が得られた。これらの株のトランスポゾン挿入部位を解析することで、膜小胞生産性の向上や低下をもたらす遺伝子変異を同定することができた。
【膜小胞へのタンパク質積み込み機構の解析】S. vesiculosa HM13 の膜小胞主要積荷タンパク質 P49 の細胞外への移行機構を調べた。P49 遺伝子上流には、Ⅱ型分泌装置 (T2SS) の構成成分である GspD、GspK、GspF、GspE のホモログがコードされており、これらを欠損させると P49 が細胞外に移行しなくなる。これらの遺伝子の近傍遺伝子がコードする機能未知タンパク質について、立体構造予測プログラム I-TASSER および AlphaFold2 を用いて構造予測を行った結果、T2SS のサブユニットである GspB、GspJ、Type IVa pilus machine のサブユニットである PilO、PilN、PilA に類似した構造を有すると予測されるタンパク質が見いだされた。また、これらの欠損株では膜小胞から P49 が消失することが確認された。以上の結果から、これらのタンパク質群が T2SS 様分泌装置を構成し、P49 の細胞外への移行を担うものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
S. vesiculosa HM13 の膜小胞生産性のハイスループット評価系を構築し、トランスポゾン変異株ライブラリーのスクリーニングを効率的に進めることができた。これにより、膜小胞形成への関与が示唆される新奇遺伝子群の同定に成功した。また、膜小胞積荷タンパク質の輸送を担う分泌装置の同定においても大きな進展があった。一方、膜小胞への移行に必要な積荷タンパク質の構造要素の絞り込みはできておらず、膜小胞に外来タンパク質を効率的に輸送するシステムの構築も未達成であることから、「おおむね順調に進展している」と評価することが妥当と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
曲率認識ペプチドを用いたトランスポゾン変異株ライブラリーのスクリーニングを継続し、膜小胞生産に関わる遺伝子群を網羅的に同定する。同定された遺伝子、およびゲノム上の周辺遺伝子群について、配列や立体構造予測に基づいた機能推定を行う。その結果に基づいて膜小胞形成機構に関する仮説を立て、実験的に検証する。一方、積荷タンパク質と相互作用する膜小胞表層多糖について、その生合成遺伝子の改変によって、積荷タンパク質への結合能を失った変異型多糖を調製し、その構造解析を行うことで、積荷タンパク質と相互作用する糖鎖構造を明らかにする。また、外来タンパク質との結合に利用可能な架橋性タグ配列を膜小胞表層積荷タンパク質 P49 の様々な部位に導入し、それらの膜小胞移行性を評価する。効率的に膜小胞に移行したタグ挿入型 P49 を用いて、膜小胞に外来タンパク質を積み込むシステムを構築する。
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| Causes of Carryover |
トランスポゾン変異株ライブラリーのハイスループットスクリーニングの条件設定に想定以上の時間を要した。また、膜小胞表層多糖の化学構造を、立体配置まで含めて厳密に決定することにも想定以上の時間を要した。一方、外来タンパク質を膜小胞に積み込む手法の開発においては、積荷タンパク質に直接融合する手法では効率的な膜小胞への輸送が困難であることが判明したため、鎖長が短い架橋性タグ配列を積荷タンパク質に導入し、タグ配列を介して外来タンパク質を積荷タンパク質に結合させる手法に切り換えることにした。これらの要因により、当初計画していた実験を今年度中に完了することが困難な状況となった。未使用分は、当初計画した実験を進めるための遺伝子工学用試薬、変異株スクリーニング用試薬、培養用試薬、プラスチック器具などの消耗品購入に使用する計画である。
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