2021 Fiscal Year Research-status Report
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20K20579
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | CRISPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、ゲノム編集ツールとして広く利用されている。一方、最近発見されたCas12kはガイドRNAと複合体を形成し、ガイド配列と相補的な2本鎖DNAに結合する。Cas9と異なり、Cas12kはDNA切断活性をもたず、Tn7様トランスポゾン因子（TnsB、TnsC、TniQ）とCAST（CRISPR-associated transposase）複合体を形成し、ドナーDNA中の特定のカーゴ配列をターゲットDNAに挿入する。既知のトランスポザーゼはターゲットDNAの様々な部位にドナーDNAのカーゴ配列を挿入するのに対し、CAST複合体はCas12k-ガイドRNAの結合部位から約60塩基下流の位置にカーゴ配列を選択的に挿入する。ドナーDNAの挿入部位はガイドRNAによって規定されるため、CASTを用いることによりDSBを引き起こすことなくゲノムの狙った位置へのノックインが可能であると期待されている。しかし、Cas12k、TnsB、TnsC、TniQは新規のタンパク質であるため、CASTによるDNA転移反応の分子メカニズムは謎に包まれている。本年度は、Cas12k-ガイドRNA-標的DNAとTniQを混合したのち、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて複合体を精製、クライオ電子顕微鏡を用いて粒子像を取得し、単粒子解析を行い高分解能の密度マップを取得した。得られた密度マップを用いて、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA複合体の構造決定に成功した。今後は、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-TniQ複合体の再構成条件の最適化を行い、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-TniQ複合体などの構造決定を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cas12k-ガイドRNA-標的DNA複合体のクライオ電子顕微鏡構造の決定に成功したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-TniQ複合体などの構造決定を目指す。
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| Causes of Carryover |
Cas12kとコファクターとの間の相互作用をさらに検討する必要が生じたため。
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