2021 Fiscal Year Research-status Report
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20K20582
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2026-03-31
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| Keywords | 多次元1細胞全ゲノム解析 / ゲノム増幅法 / scRepli-seq / scHi-C |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は1細胞全ゲノムDNA複製解析技術であるscRepli-seq法を開発した。この独自の基盤技術を更に発展させるべく、本研究は（１）scRepli-seqの「第二世代化」による解像度の飛躍的向上、（２）scRepli-seqを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析の実現、の二つを目的としている。現在、我々のscRepli-seq法が採用しているのは指数関数的ゲノム増幅法（DOP-PCR; Degenerate oligonucleotide-primed PCR）だが、scRepli-seqの解像度をさらに向上させるために、これを線形ゲノム増幅法LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion; Chen et al., Science 2017）に変更する必要があると考えている。そのため、今年度も引き続きLIANTI法に取り組んだが、色々な問題に直面してまだ再現には至っておらず、一つずつ問題を解決している段階である。LIANTI法ではTn5 transposaseによるtagmentationという方法を用いてゲノムを断片化するが、現在、この断片化が上手く行くっておらず、当然その先にあるIVT（in vitro transcription）も上手く行っていない。断片化のステップについては、共同研究者から入手したTn5 transposonを用いて、ゲノムDNAを断片化の対象として条件検討を重ねた結果、至適条件を見出したと思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は（１）scRepli-seqの「第二世代化」による解像度の飛躍的向上、（２）scRepli-seqを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析の実現、の二つを目的としているが、まずは第一の目的を達成する必要がある。第一の目的、すなわち、scRepli-seqの解像度をさらに向上させるためには、scRepli-seq法の工程にあるゲノム増幅法を、最新の線形ゲノム増幅法LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion; Chen et al., Science 2017）に変更する必要があると我々は考えている。そのため、今年度も引き続きLIANTI法の再現に取り組んだ。当初考えていた以上にこの手法は難しく、再現するまでにはいくつかの障壁を越える必要がありそうだが、Tn5 transposaseによるゲノム断片化（tagmentation）のステップについては、試行錯誤の末に至適条件を見出したところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度も引き続き、scRepli-seq法の工程にあるゲノム増幅法を、線形ゲノム増幅法LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion; Chen et al., Science 2017）に変更する試みを続ける。まずはLIANTI法を我々の手で再現する必要があるため、ゲノムDNAを対象としたゲノム断片化の条件を早く確定させる。そして、対象を少数細胞由来あるいは単一細胞由来のクロマチンに変えてゲノム断片化を行うとともに、これと並行して、その先にあるIVT（in vitro transcription）のステップの最適化に取り組みたい。ゲノム増幅方法については、LIANTI法に加えて、META（Multiplex End-Tagging Amplification; Tan et al., Science 2018）法も引き続き試すことを計画しており、LIANTI法とMETA法の比較検討を行いたい。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響で海外メーカー製 試薬・物品の生産中止や調達遅延が重なり、また代替製品の確保にも時間を要することが多く、検討予定実験が連続的且つ円滑に試行できない状況が幾度か生じた為
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