2020 Fiscal Year Research-status Report
Expanded understanding of molecular mechanisms governing pluripotency by focusing on non-canonical translation.
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20K20585
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高橋 和利 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点准教授 (80432326)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩崎 未央 京都大学, iPS細胞研究所, 特定助教 (10722811)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2026-03-31
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| Keywords | 非標準的翻訳 / 分化多能性 / リボソーム / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非標準的な翻訳を受けるRNA (non-canonical translated RNA: nctRNA) を網羅的にマッピングする目的で、ヒト分化多能性幹細胞 (H9 胚性幹 (embryonic stem: ES) 細胞株およびWTB6 人工多能性幹 (induced pluripotent stem:iPS) 細胞株) を用いて以下に示す試料を調製した。
1) 全RNA: すべての転写産物を網羅的に検出しnctRNAのマッピングに使用する。2) 核-細胞質分画RNA: マッピングしたそれぞれのRNAが細胞内のどこに局在するかを示す実験に使用する。3) ポリソーム分画RNA: 翻訳阻害薬であるCycloheximide (CHX) で処理し、リボソームとRNAを固定した状態でスクロースグラジエント法により分画したRNAを用いて、実際に翻訳されているRNAを検出するための実験に使用する。4) リボソーム結合RNA: 上記のようにCHX処理したRNAをRNaseで処理することで、消化されないリボソーム結合RNAをマッピングするための実験に使用する。
今年度は、上記の試料を調製し、RNAシークエンシングによるデータ取得を行った。また今後実施予定である、ヒト分化多能性幹細胞から作製した分化細胞における非標準的翻訳RNAプロファイリングの準備として、分化誘導の条件検討を実施し至適な分化誘導条件を決定した。また、マッピング後の機能的スクリーニングに用いるCRISPR interference (CRISPRi) の条件検討、細胞株の作製およびライブラリーの調製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度に得たデータを用いて、インフォマティクス解析を実施し、RNAのマッピングおよびリボソームプロファイリングによる実際に翻訳されている領域の決定を行う。決定した翻訳領域の配列情報を、質量分析法を用いたタンパク質発現解析結果と照らし合わせる。nctRNAがコードするタンパク質はその多くが100アミノ酸以下であると考えられるため、細胞抽出液を透析膜処理し低分子量画分を濃縮することで発現量の低いタンパク質も確実に捉える。これにより、実際に翻訳されるRNAと実際に発現しているタンパク質を照らし合わせ、信頼性の高いマップを作成する。
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| Causes of Carryover |
RNAシークエンシングおよび細胞培養に用いる消耗品の使用が当初の予定より少なくなったために、計上していた予算を下回った。本年度は昨年度未執行の予算を用いて、RNAシークエンシング、質量分析や大規模なスクリーニングを実施する。
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