2022 Fiscal Year Research-status Report
Sex difference and evolution of the brain illuminated by Connect-Seq: A novel single-cell level neural circuit mapping tool with cell type annotation
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20K20589
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
宮道 和成 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (30612577)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2024-03-31
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| Keywords | 神経回路 / 狂犬病ウイルス / バーコード / トランスクリプトーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
複雑な神経系の構成原理を理解するためには、個々のニューロンのトランスクリプトーム(TC) により規定されるタイプとそれぞれの接続頻度とを紐づけた定量的情報が必要となる。本研究では、狂犬病ウイルスベクターを用いたコネクトミクスを基盤として、そこにTC細胞タイプの情報を統合する手法やそれを利用したbiologyの開拓を目指している。2022年度にはこのようなアプローチの一つの成果として、雄マウスが交尾・パートナーの出産を経て父親になる際に変動する神経回路を探索し、外側視床下部の興奮性神経細胞 (特にMCH陽性タイプを多く含む)から室傍核オキシトシン神経細胞への神経回路の変化を同定した。また、雌マウスが妊娠・出産を経て母親になる過程で変化する神経回路網についても検討を行った。これらを皮切りに本研究テーマから多数のbiologicalに重要な課題が表出しており、活発な研究へと発展している。
狂犬病ウイルスベクターに多数の分子バーコードを付与する技術開発はすでに実施済みであるが、問題は神経細胞を酵素処理により単一細胞にして回収する効率が低すぎることである。そこで、10xChromium社の提供するプラットフォームを用いて数万個の細胞核を集めてdropletベースのRNAseqに供することを目指し、まず、cold runとして視床下部室傍核の解析を実施した。この際には健常発達群に加えて、社会性行動に異常を呈する神経疾患のモデルマウスを用いることで、室傍核の様々なTC細胞タイプにどのような異常がみられるかを検討した。その結果、社会行動に深く関与すると考えられる特定のTC細胞タイプにおいて特定のシグナル経路の転写ネットワークが障害されていることを明らかにした。
このように本テーマは技術要素の実装とbiologyの開拓の両面において順調に進捗している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究テーマの計画段階では、バーコードを付与した狂犬病ウイルスベクターを用いたトランスシナプス標識法に一細胞TC解析の連結を目指した。しかし予備調査において神経細胞を単離して一細胞RNAseqを実施する効率が低すぎて、殆どのバーコードが“迷子”になってしまうという問題が懸念された。実際、同様の手法を開発する海外のチームでは、単離の容易な血球系細胞とグリア細胞の相互作用を解析したり (Clark IC Science 372, eabf1230, 2021)、胎児脳の分散培養系を使った原理証明が発表されてたりした (Saunders A et al. Nat Comm. 6993, 2022)。米Allen研究所のチームが先月発表したプレプリントによると、FACSを用いる一細胞RNAseqは効率の問題から本手法に不向きであり、空間TC手法のBARseqを用いてバーコードを読みだす技術が有望とされた (Zhang A et al. bioRxiv 532873, 2023)。このような状況から本研究では、狂犬病ウイルスベクターを用いたトランスシナプス標識法の高度利用化や一細胞核 (sn) RNAseq法を組み合わせたbiologyの展開に重心をシフトし、この方向性から２報の論文発表、1報のプレプリント発表を行い、現在も活発な研究進展がみられる。また、狂犬病ウイルスベクターで標識された細胞のsnRNAseq解析に関してはまだ技術的にも生物学的応用の面からも追及するべき課題が多く存在することから、引き続き一細胞RNAseqや10x Chromiumのプラットフォームと連結する手法を活発に研究中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、室傍核のsnRNAseq解析から見えてきた社会性行動異常を持つマウスの転写ネットワークの異常については、これを回復（治療）する手法の開発と共に早期の研究論文発表を実施する。また同様の手法を用いて、脳の雌雄差や状態（非妊娠、妊娠、授乳期など）の差異に関する研究を進める。さらに、当初のプランにあるように将来的に異種間の神経回路の比較を実施するための基盤として、冬眠動物モデルハムスターに対するsnRNAseqの応用にも着手する予定である。
狂犬病ウイルスベクターとトランスクリプトーム解析の連結に関しては、FACSでの取得に便利な核局在型標識を持つウイルスベクターを新規に構築し、機能テストののち、同ウイルスベクターを用いて妊娠期に生じる神経回路変化の細胞構成の研究を展開する。この際には、酵素処理により単離した一細胞をFACSで分取する手法と、10xChromiumのプラットフォームにより多数の細胞核にバーコードを付与する手法を並列に試験し、効率や精度を評価する予定である。
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| Causes of Carryover |
年度末近くに実行していたRNAseq実験に関し、マウスの生育上の問題から実施がやや遅くなり、シークエンス費用の約20万円を2023年度側でしようすることとしたため次年度使用額が発生した。2023年度として請求した額と合わせ、予定通り、室傍核のsnRNAseq解析から見えてきた社会性行動異常を持つマウスの回復過程の理解や性差・妊娠に伴う転写ネットワークの変化の研究を進める予定である。
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