2021 Fiscal Year Research-status Report
Identification and control of follicular helper T cell clonotype related to donor specific HLA antibody production
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20K20608
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
小林 孝彰 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70314010)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩崎 研太 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (10508881)
三輪 祐子 愛知医科大学, 医学部, 助教 (90572941)
安次嶺 聡 愛知医科大学, 医学部, 講師 (00547375)
西村 泰治 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 名誉教授 (10156119)
岸 裕幸 富山大学, 学術研究部医学系, 教授 (60186210)
一戸 辰夫 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (80314219)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 移植・再生医療 / 腎移植 / HLA抗体 / 抗体関連型拒絶反応 / 濾胞ヘルパーＴ細胞 / Ｔ細胞受容体クロノタイプ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
臓器移植後の抗ドナーHLA抗体(DSA)産生による慢性拒絶反応の制御を目的とした研究である。プロジェクトに分けて効率的な研究を進めている。令和３年度に得られた研究成果をプロジェクトごとに記す。
【１】腎移植後末梢血PBMCのmRNAを用いてde novo DSA 産生に関わる複数のTCR候補を同定した。さらに、ドナー細胞に対するMLRを行い反応するT細胞を回収し、TCR解析を行ったところ、末梢血mRNAと同じCD4, CD8のTCRを見出した。
【２】上述のアッセイ系はdirect recognition pathwayによるT細胞応答を検出するものであり、抗体産生系に直接関わるIndirect recognition pathwayによるT細胞応答を解析する必要がある。ドナーPBMCを貪食したレシピエントdendritic cell (DC)に対するCD4T細胞の反応を解析するELISPOTアッセイ（IFNr or IL-21）を開発し、移植前DSA（preformed DSA）陽性患者においては、メモリーT細胞の反応性が高いこと、移植後のde novo DSA産生患者においては、移植前には存在しない 反応性の高いメモリーT細胞が存在した。
【３】免疫不全マウス（NSG）にDSA産生ヒト細胞（PBMC）移入後、3回ドナーPBMCで刺激し、HLA抗体産生を確認することができた。１例は、末梢血中で産生が確認されたものと同じHLA class 1 (HLA-A*11:01, HLA-B*15:01)抗体であったが、１例は抗体産生がみられないミスマッチDRB1*14:06に対する抗体がNSGマウスで検出された。
【４】上述したようにdirect recognitionの系では、de novo DSA産生患者の末梢血と共通のTCRを検出したが、Indirect のTCR解析を行ったところ、共通TCRを見出せなかった。ドナー細胞貪食DCに対する反応Ｔ細胞として、細胞増殖、サイトカイン産生、活性化マーカーにより回収し、シングルセル解析の必要性が明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
５つのプロジェクト研究においては、進行に差があるものの、全体としてほぼ順調に成果が得られており、計画は予定通り進行していると考える。
【１】DSA産生に関わるCD4T細胞TCRの同定と検証、【２】Donor由来peptide/recipient MHC class II complexに反応するCD4T細胞の検出、【３】ヒト化マウスによるDSA産生モデルの作成、【４】DSA産生に関わるCD4T細胞TCRの移植前予測の可能性 においては、課題を明確にしながら順調に進んでいる。
【２】では、Indirect Recognition Pathwayを反映するin vitro assayを開発し、次にシングルセル解析の必要性から新たなる方向性を目指して、解析方法を開拓中である。試行段階であるが、ドナーPBMC pulsed DCに対するCD４T細胞の反応増殖は認められたものの、特定のクローン増殖には至らなかった。さらなる解析の改良を行なっている。
【３】では、方法の改善により２例においてマウスよりDSA産生を確認できた。 移入細胞を工夫することでモデルの開発につなげる。これらのin vivo実験にて経過とともに反応する移入細胞のTCR解析も行い、臨床例でのTCRと比較する。
そのほかには、進行中の研究として、de novo DSA産生の末梢血よりB細胞をEBVを用い不死化し、DSA産生に関与するＢ細胞クローンを樹立中であり、また、単一のHLAクラス２抗原を発現する細胞株を樹立しつつあり、次年度の研究に利用する予定である。【５】濾胞ヘルパーT細胞(Tfh)および濾胞制御性T細胞(Tfr)のTCR解析と選択的誘導においては、昨年度と同じ目標で行っている。DSA産生責任Tfh TCRを同定後、診断だけでなく治療に応用する可能性を検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
残りの期間も研究の方向性には大きな変更を加えず、当初の予定通り５つのプロジェクトを中心に研究を進めていくが、【１】DSA産生に関わるCD4T細胞TCRの同定と検証、【２】Donor由来peptide/recipient MHC class II complexに反応するCD4T細胞の検出、【４】DSA産生に関わるCD4T細胞TCRの移植前予測の可能性においては、連動した研究が行われる必要があり、T細胞受容体レパトア解析、シングルセル解析を中心に実施していく。
de novo DSA産生例の臨床検体を用い、開発した Indirect Recognition PathwayによるT細胞アッセイでのシングルセル解析により、DSA産生に関わるTCR を同定する。sequence結果よりrecombinant TCR（α、β）発現培養細胞を樹立する。 HLA peptide ligandomics解析、またはPIRCHEアルゴリズムで推定されたpeptide候補を用い、peptide-pulsed DCを用い、Tfh細胞の反応性を確認する。 現在、開発中の単一HLA抗原（クラス２）発現COS７細胞株、EBVにより不死化したB細胞を用いて検証をする予定である。
【３】ヒト化マウスによるDSA産生責任CD4T細胞TCRの同定と検証（in vivo モデル）では、de novo DSAを産生するPBMCの移入で成功したので、次に、感作前の状態での検出を試みる。健常人PBMCに対する感作PBMC貪食CD14細胞との事前培養により形成された memory T, B細胞の移入によるDSA検出を試みる。これらのマウスモデルにて、TCR解析を行い、in vivoでの結果（臨床例）との比較検討を行う予定である。
【５】濾胞制御性T細胞(Tfr)の選択的誘導については、nanoparticle（HLA-multimer）の可能性について、検討を継続する。これらのプロジェクト研究で得られた結果を取りまとめて、学会、論文発表を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、indirect recognition pathway のアッセイの開発、細胞株樹立に重点を置いた。そのため、試行錯誤による研究ではあるが、購入物品、人件費を利用しても、繰越金が可能となっている。購入計画はすでに立てており、年度をまたいでの支払い予定の物品費もある。次年度は、繰り越し分をあてて、集中的にシングルセル解析、Ｔ細胞受容体解析を行い、樹立した細胞株（シングルＨLA発現細胞、ＤSA産生Ｂ細胞）を用いた実験を追加する。研究資金の計画的な使用を行っている。
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