2020 Fiscal Year Research-status Report
Deterministic Massively Parallel Single Cell Processing: Towards Innovation in Bio-3D Printing
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20K20961
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
永井 萌土 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00580557)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
沼野 利佳 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30462716)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞プリンティング / 光硬化性樹脂 / 超並列単一細胞操作 / 細胞被覆 / 多点光照射 / ノズルアレイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体外で緻密な多細胞組織を超並列で10の6乗個形成できれば，十分な細胞間相互作用により生体内の状態を再現し，腫瘍や臓器の生命現象を効率的に調査できる。組織構築には，バイオインクとヒト細胞（直径約15μm）の懸濁液を吐出し，硬化後に細胞を成熟させる。従来のバイオ3Dプリンティングの配置は，トレードオフが存在し，高い並列処理数と細胞個数の制御性は両立できなかった。並列ノズルにしても，確率論的な配置となり，個数と距離を厳密に規定できず，細胞間相互作用の安定した再現が困難であり，変革が望まれていた。
そこで本研究では，申請者の有する細胞操作技術，微細加工技術をベースに，構造を知能化・2Dアレイ化するアイデアにより，原理を刷新する。決定論的な細胞加工へと飛躍させ，細胞間相互作用の安定した再現を行う。 決定論的超並列(10の6乗個)単一細胞加工技術((A)単一細胞分離，(B)ゲル被覆，(C)ノズルへの充填・吐出，(D)位置固定)を創成することを目指した。
多層構造からなる10個の透明ノズルアレイを微細加工技術で形成した。ノズル(直径30μm)と隣接したチャンバを合計10個配置した。チャンバ上部に，流れ切替用にはバルブを設けた。(A)捕獲時に細胞はチャンバ内の捕獲部（高さ5μm）に向かった。捕獲後，チャンバへ向かう流れが止まり，単一細胞のみがトラップされた。(B)ミネラルオイル（油相）で押し出し，余分なインクを除去し，インクで被覆した細胞を得た。(C)細胞捕獲後には，バルブを開け，ノズルへの輸送を試みた。細胞の付着により脱離が不十分であった。
細胞の位置固定技術として，光照射後ゲル内細胞を経過観察した。ゲル内細胞の増殖が確認され，細胞培養における指数関数的な増殖を示した。さらに細胞はゲルを分解した。1週間の長期的な高生存率を保ち，細胞プリンタに有用な硬化条件と光硬化性ゲルであることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ノズルアレイの作製が安定的に行え，また細胞を使った評価も進んでいる。さらに光照射で細胞をゲルで固定し，そのゲルも細胞にとって低侵襲であることを示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞捕獲後には，バルブを開け，直径30μmの開口への輸送を試みたが，細胞の付着により脱離が不十分であった。この点に対しては，ノズルアレイの流路表面を処理し，細胞の脱離を容易にすることで改善する。
細胞の加工原理を発展し，細胞の3D配置が繰り返しできるように自動化する。照射光学系，ノズルアレイの空圧系， XYZステージを統合し，自動制御する。生分解性のバイオインクを用い，濃度，他成分との混合，被覆厚を変化させ，数日培養の後，インクが生分解し，細胞が密着することを示す。分担の沼野准教授と協力し，iPS細胞由来の胚性細胞をアレイ状に配置し，個数・配置を多条件で変化させて細胞増殖と移動を計測し，臓器形成につながる発生生物学的な情報を得る。
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| Causes of Carryover |
特に物品費である消耗品や装置類を購入せずに研究が進捗できたことにより，次年度使用額が生じた。さらには新型コロナウイルス感染症の拡大の影響から，出張が困難になったため，旅費の使用ができなくなった。人件費も2020年度の雇用時間が短かった。これらの残額は，2021年度にまとめて消耗品と自動化の装置を導入し，さらに雇用時間を長くすることで使用する。
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