2020 Fiscal Year Research-status Report
がん関連タンパク質の働きを同時に制御するハイブリッド抗体酵素の開発
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20K21255
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
一二三 恵美 大分大学, 全学研究推進機構, 教授 (90254606)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | PD-1 / PD-L1 / 免疫チェックポイント / 抗体酵素 / T細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内では、がん化した異常細胞の攻撃役としてT細胞が用意されているので、このT細胞を活性状態で維持すれば、がんの種類とは無関係に殺傷することが出来る。しかしながら、がん細胞の中には攻撃を回避するためのツールとしてPD-L1を発現しているものがある。T細胞上のPD-1が、がん細胞上のPD-L1により不活性化させると、がん細胞の増殖を抑えることが出来ず、病態は悪化する。そこで、本研究では、高抗がん作用を発揮する機能性分子として、T細胞（PD-1）とがん細胞(PD-L1)の双方に採用するハイブリッド型抗体酵素の作製を進める。今年度の研究実施内容は以下の通りである。
（１）PD-L1に対するスーパー抗体酵素の作製：初年度の計画としては、主にPD-L1に対するスーパー抗体酵素の作製を進める計画であったことから、申請者が所有している抗体酵素バンクに対するスクリーニング用抗原のFRET-PD-L1ペプチドの準備から開始した。PD-1との結合部位や取得する抗体酵素の反応特異性を考慮して2種類のPD-L1ペプチドの合成とFRET修飾を計画した。しかしながら、合成収量が上がらず、時間を要したため、合成が終了した段階で年度を終えた。
（２）PD-1に対するスーパー抗体酵素H34のキャラクタリゼーション：PD-1を分解するスーパー抗体酵素のH34は、典型的なスーパー抗体酵素のアミノ酸配列を取っておらず、異なる機序が予想された。そこで、Protease阻害剤を用いる阻害試験や、変異導入による活性サイトの推定などを実施した。これらの結果から、本クローンの酵素活性は亜鉛などの２価の金属イオンの影響を強く受ける点が従来型のスーパー抗体酵素とは異なるが、Pro95が酵素活性の発現に強く影響する点は従来型と同等であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画では、今年度はPD-L1に対するスーパー抗体酵素の作製を柱に進める計画であった。スクリーニング用の基質となるペプチド配列を決定し、その合成とFRET修飾を依頼したところ、合成収量が低いことに加えて新型コロナの影響で、輸送にも想定外の時間を要すことになり、入手が年度末近くになった。そこで、既に取得していたPD-1に対するスーパー抗体酵素のH34が、本研究で用いる材料として十分な機能を有するか否かを含めたキャラクタリゼーションを行った。本クローンは、これまで取り扱ってきたものとアミノ酸配列の特徴が大きく異なっており、新たな作用機序による酵素活性発現が示唆されていた。速度論的に解析した酵素活性は、高値を示し、本研究課題で使用するに相応しいと判断出来た。本クローンで処理したPD-1がPD-L1に対する結合能を消失していることも確認出来、新たなタイプの抗体酵素としての特徴も明確化出来たことから、順調に進展していると判断した。最後に、令和2年度は、卒論・修論研究に大きな制限が出来たり、物品の入手が困難になるなど、新型コロナの影響が予想以上に大きい年であったことを付け加えておきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度に合成した2種類のFRET-PD-L1ペプチド基質を用いて、申請者が所有する抗体酵素ライブラリーに対するスクリーニングを行う。分解能を示すクローンが得られれば、酵素活性を速度論的に解析し、ハイブリッドの作製に使用可能か否かを判断する。良好な酵素活性を示した場合には、本クローン単独で用いる場合の反応性の特徴を免疫学的な側面と、酵素機能の2つの観点から分析し、データシートとして整える。このデータは、ハイブリッド抗体酵素の機能評価に於いて、比較対照として用いるものである。
ライブラリーから高いPD-L1分解活性を示すクローンが取得出来なかった場合には、公開されている抗PD-L1抗体の配列を元に、その軽鎖全長タンパクを組み換えタンパクとして大腸菌（BL21(DE3)pLysS）で発現させ、申請者らが開発した技術を用いて変異導入による軽鎖の酵素化を進める。
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| Causes of Carryover |
一部計画を変更して進めたため、遺伝子組み換え関連の試薬や器具類の購入を持ち越した。また、PD-1，PD-L1タンパクの追加購入を計画していたが、新型コロナの影響で12月頃から輸入手配の目処が立たなくなったことから、令和3年度の購入に切り替えた。
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