2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of methodology for subtractive design of microbiota
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20K21275
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
本田 孝祐 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 教授 (90403162)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 菌叢 / 減算的制御 / 細胞膜透過ペプチド / Casヌクレアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、微生物群集（菌叢）を構成する各種細菌のうち、特定の属や種の細菌に対して特異的に細胞死を誘導し、菌叢の構成菌種を減算的に制御するための基盤技術開発に取り組むものである。その戦略として本研究では、細胞膜透過ペプチドとCasヌクレアーゼを組み合わせ、外部から添加したCasヌクレアーゼにより対象とする細菌のゲノムDNAを切断し、種選択的な細胞死を誘発することを試みる。当該年度は、大腸菌をモデル細菌とした各種試験を行い、細胞死誘導に利用可能な分子ツールの取得を試みた。
耐熱性緑色蛍光タンパク質（TFP）に対して、既知の細胞膜透過ペプチドを付加した融合タンパク質を調製し、これらの大腸菌細胞内への取り込みを定量した。この結果、調査した6種類のペプチドのうち、2種類で大腸菌細胞画分へのTFPの移行が確認された。
また、細胞内へのタンパク質の取り込みの良し悪しは、当該タンパク質のサイズに大きく左右されるとの予測のもと、ミニチュアCasヌクレアーゼとして知られるCas12f1の機能評価を行った。Cas12f1を利用し、大腸菌ゲノム上にコードされた複数の遺伝子に対するノックアウト試験を行ったところ、汎用CasヌクレアーゼであるSpCas9と同等以上のゲノム編集効率が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モデル実験により細菌細胞に対する透過性を有したペプチドを複数獲得することに成功した。またミニチュアCasヌクレアーゼであるCas12f1の動作確認を行い、本酵素が大腸菌ゲノムに対して汎用Casヌクレアーゼと同等以上の編集効率を示すことを明らかとした。以上の取組により、モデル細菌である大腸菌に対し、細胞死を誘導するための分子材料が整ったといえる。なおCas12f1に関する成果は現在査読付き論文として投稿中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に取得された2種類の細胞膜透過ペプチドを用いて、大腸菌細胞内へのCas12f1タンパク質の導入を行う。この際、タンパク質導入の成否を表現型として検出すべく、薬剤耐性遺伝子をマーカーとした評価系を作成する。開始コドンに部位特異的塩基置換を導入する等して不活化した薬剤耐性遺伝子を大腸菌のゲノム中に組み込む。当該変異点を標的とするsingle-guide RNAと融合させたCas12f1タンパク質を細胞膜透過ペプチドを用いて取り込ませ、ゲノム編集により変異点を修復させる。Cas12f1タンパク質が細胞内に導入され、期待どおりのゲノム編集が生じた細胞のみが薬剤存在下で生育可能となる。こうして開発された評価系を用いた取組みにより、外部からのCasヌクレアーゼ導入によるゲノム編集ならびに細胞死誘発のための基本スキームを完成させる。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍による出張取りやめのため、また探索試験（細胞膜透過ペプチドのスクリーニング）において、当初の予想よりも少ない試行数で目的にかなったペプチド分子が得られたため、次年度使用額が生じた。次年度は、2020年度に得られた細胞膜透過ペプチドやミニチュアCasヌクレアーゼを用いた検証試験を中心とした研究を計画しており、そのための試薬類やDNA配列解析外注費として、本財源を活用する。
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