2021 Fiscal Year Research-status Report
嫌気的呼吸能の付与による、余剰還元力を活用した微生物物質生産系の開拓
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20K21287
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
中澤 昌美 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (90343417)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柏山 祐一郎 福井工業大学, 環境情報学部, 教授 (00611782)
坂元 君年 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50361465)
藤原 崇之 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 助教 (10595151)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 低酸化還元電位型キノン / 余剰還元力 / 物質生産 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度に獲得した、大腸菌変異株ΔmenA、真核光合成生物Cyanidioschyzon melorae（シゾン）の低酸化還元電位型キノン合成株（以下、キノン改変株と記載）を用い、嫌気条件下での有機酸合成能力を検証した。
まず、大腸菌キノン改変株では、コントロール株と比べ培養上清中のリンゴ酸が減少すると同時に、コハク酸量が大幅に増加した。さらに、嫌気培養時の酸化還元バランス（NADH/NAD+）を測定した結果、コントロール株では通気条件と比べて嫌気条件で酸化還元比が大きくなっていたことに対して、キノン改変株では酸化還元比がほとんど変化しなかった。さらに、これらの株について内膜の電子伝達反応の活性を測定したところ、キノン改変株においてNADH-fumarate活性が約1.3倍増加していた。このことから、RQ合成能力の付与はコハク酸生産と共役したNADH/NAD+の低下に寄与し、嫌気条件下における細胞内の還元状態を解消できる可能性が示唆された。
シゾンの系では、培養条件を改善し、貯蔵多糖の蓄積を増加させる窒素欠乏の状態を経た後嫌気条件に曝すことで、合成させる有機酸量を高めた上で、キノン組成変化による影響を調べた。その結果、予想に反して、キノン改変株で発酵経路で合成される乳酸量が大きく増加した。
本研究の全体構想では、真核生物モデルとして出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおける低酸化還元電位型キノン合成も目指していたが、前年度の検討では、タンパク質の発現および芸酸化還元電位型キノンの合成が検出されない状況であった。そこで、宿主を分裂酵母Schizosaccharomyces pombeとした発現系構築を進めた。その結果、分裂酵母で低酸化還元電位型キノンが合成されたことを機器分析により確認できた。しかし、その合成量は最大で総キノン量の約1.5%程度にとどまった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本来であれば、本年度で研究終期であったが、コントロールした嫌気培養実験のために購入したジャーファーメンターが、メーカーのコントローラー制御プログラムのバグにより目的用途の方法では正常に運転できず、さらに、その改修がR4年度に持ち越されたため、機器トラブルによる終期延長を申請した。一方で、酸素吸収剤を用いた簡易な嫌気培養の系は十分に条件検討できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本来は本年度で研究終期を迎える予定であったが、予定より実際の稼働が遅れた、ジャーファーメンターによる嫌気度の詳細な調整が可能な系を用いて、大腸菌キノン改変株の代謝変動確認を進める。さらに、シゾンの系では、低酸化還元電位型キノンの合成量が異なる株における有機酸への変化を重点的に捉える。
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| Causes of Carryover |
機器のトラブルにより、研究終期を1年延長したため。使用計画は、当初2年度目に行う予定にしていた研究計画を実施する予定である。
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