Molecular mechanisms for apyrene sperm differentiation

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21299
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 金児 雄 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (90633610)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐原 健 岩手大学, 農学部, 教授 (30241368)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 無核精子 / コミットメント

Outline of Annual Research Achievements

進化的なチョウ目昆虫は、核のある有核精子と核のない無核精子を作る。有核精子と無核精子は、精巣の同じ精室内において同一の精原細胞から作られる。しかしながら、どのようにして有核精子と無核精子を作り分けているのか、その分子機構は十分に解明されていない。予備的な知見として、申請者らは昆虫ホルモンが無核精子形成を阻害するという結果を得つつある。このことから、無核精子形成にコミットメント様の切り替え機構が存在すると仮定した。また2019年に、カイコsex lethal遺伝子（BmSxl）のゲノム編集によるノックアウトカイコにおいて、無核精子の形態異常を生じることが報告された。そこで、sex lethalと昆虫ホルモン、コミットメントとの関係性を明らかにすることを中核におき、無核精子形成の分子機構の解明を目指している。まず、sex lethal遺伝子の正確な発現時期を調べるために、カイコの精巣を終前齢期から蛹期までを通して継時的に摘出し、発現解析を行うためのcDNAを作製した。また昆虫ホルモンによるBmSxl発現への影響を検証するために、昆虫ホルモン投与後、24時間ごとに精巣を摘出して、total RNAを抽出した。また対象区として、未処理の個体から同様の条件で精巣を摘出して、比較解析の準備を整えた。さらに、BmSxlの下流の分子機構を解明するために、BmSxl TALEN mutantの精巣からのサンプリングも行なった。これらのことにより、分子機構の解明への材料を整えることができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度において、昆虫ホルモンとカイコsex lethal遺伝子(BmSxl)の関係性を検証するための準備を整えることができた。また、コミットメントの確認実験について、体液中におけるホルモンの変動が詳細に確認されているカイコ系統において、有核精子と無核精子の形態観察のための染色実験が十分に機能することが確認できた。この様に、コミットメント実験および関連遺伝子の探索のための研究基盤形成が進捗した。これらのことから、申請研究は順調に進められている。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子発現解析研究の基盤が整ったことから、定量PCRを用いた解析を行う。具体的には、sex lethal遺伝子(BmSxl)の発育に沿った解析、ホルモン投与によるBmSxlの発現動態の変化を解析する。無核精子への分化が、昆虫ホルモンおよびグルコースによって促進されることから、BmSxl TALEN mutantの精巣において、ホルモンおよび栄養関連遺伝子の発現がどの様な影響を受けるかについて検証することで、分化とsex lethalの関係性を推定する。加えて、コミットメントの時期決定についての検証も行う。さらに、機能解析のためのin vitro RNAi法について、条件検討を行い、実験系を確立する。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスの影響で、打ち合わせや予定していた学会等がオンライン開催となり旅費が生じなかった。また、感染リスクを避けるため、飼育等にかかる謝金等の経費が抑制された。加えて、サンプル調整を優先したために、発現解析にかかる費用が翌年度に持ち越された。今後、多数の発現解析を行うため、上記の理由で生じた次年度使用額は、翌年度分に加えて使用する予定である。