2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of genome editing technology without tissue culture and application to fruits and vegetables
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20K21302
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
三浦 謙治 筑波大学, 生命環境系, 教授 (00507949)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有泉 亨 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (70575381)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / トマト / 一過的発現システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物でゲノム編集を行うにあたり、通常はCas9形質転換体を作出し、ゲノム編集を行った後、Cas9を含む外来遺伝子を除くという方法がとられている。これを組織培養を経ない方法で行うことを考慮した場合、２つの障壁が考えられる。１つは組織培養を経ないために、植物体そのもので、脱分化から再分化を促す系を築く必要がある。もう１つは、Cas9といったゲノム編集酵素が一過的発現で効果があるかどうかである。まず、後者である、Cas9を一過的に発現させてゲノム編集がおきるかどうかを確かめるため、組織培養を経る方法でゲノム編集がおきるかを確かめた。トマトを組織培養によってカルスを経て再分化させる過程において、一過的にCas9を発現させてゲノム編集を行った。この際、一過的に発現させるタイミングは子葉切片を切断した際とし、発現ベクターには、植物での一過的タンパク質発現の上昇に寄与するpBYR2HSベクターを用いた。また、ターゲットとしては、糖度蓄積に関わるとされているHWS遺伝子とした。カルスから植物体を再分化させ、その植物個体からDNAを抽出し、シーケンスを行った。その結果、キメラではあるがターゲット配列にて、ゲノム編集がおきた個体が得られた。このゲノム編集個体T0個体から次世代種子T1個体を採種して、ゲノム編集による変異が遺伝されているかどうかを調べたところ、T0個体11個体のうち2個体由来の種子において、ゲノム編集による変異が遺伝されていることが明らかとなった。しかも、この次世代T1個体においてゲノム編集による変異が遺伝されている個体では、一過的に発現させたCas9はゲノム中には存在しないことが明らかとなった。これらの結果から、組織培養を経る方法ではあるが、ゲノム編集酵素を一過的に発現させて、トマトにてゲノム編集を行うことが可能であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
組織培養を経ずに、植物においてゲノム編集を行う方法は難易度が高く、大きく２つの障壁がある。１つは、組織培養を経ないために、植物体そのもので、脱分化から再分化を促す系を築く必要がある。もう１つは、Cas9といったゲノム編集酵素が一過的発現で効果があるかどうかである。今年度は、ゲノム編集酵素が一過的発現でも機能することを確認することに集中したため、1つ目の植物体そのもので、脱分化から再分化を促す系の確立に至っていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
組織培養を経る方法ではあるが、一過的にゲノム編集酵素がトマトにおいて働くことが明らかとなったので、組織培養を経ない方法でゲノム編集酵素を導入する必要がある。この方法はハードルが高いため、これまでに成功した例はないが、いくつかの組合せを試してみる予定である。具体的には、植物体の茎を切断し、サイトカイニンといった植物ホルモンを投与することで、再分化を活性化させる方法である。この再分化の時点では、植物では細胞の脱分化、細胞分裂、再分化が進む。そこで、細胞分裂が起きているところで、ゲノム編集酵素を一過的に発現させて、ゲノム編集を引き起こすという方法で試していく予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度はコロナの影響もあり、技術補佐員の確保ができず、研究の進捗に遅れが生じてしまった。次年度においては、人手を確保し、研究の遂行に注力する予定である。また、それに伴い、ゲノム編集の変異を検出するための試薬や外注費用として充てる。
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