2021 Fiscal Year Annual Research Report

A challenge to modify the vernalization requirement of root and leaf vegetables of Brassica

Research Project

Project/Area Number	20K21313
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	藤本龍神戸大学, 農学研究科, 准教授 (60620375)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	長部謙二大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (60751352)
Project Period (FY)	2020-07-30 – 2022-03-31
Keywords	アブラナ科 / 春化 / 晩抽性 / エピジェネティクス
Outline of Annual Research Achievements	前年度、ハクサイの極晩抽性系統では、BrFLC2とBrFLC3の第一イントロンに挿入が見られ、この挿入領域は高度にDNAメチル化されていることを明らかにした。また、ヒストン修飾について調べた結果、通常のハクサイ系統では低温処理期間依存的に転写抑制型のH3K27me3の蓄積が見られるが、この系統ではH3K27me3の蓄積が見られないことを明らかにした。今年度、DNAメチル化阻害剤により挿入領域のDNAメチル化の低下が見られるか調べた結果、DNAメチル化レベルの低下を引き起こすことができなかった。アブラナ科の花成誘導を人為的に制御する試みとしてエピゲノム（H3K27me3）編集を目指した。近年、ゲノム編集ツールとして有名なCRISPR/Cas9のCas9遺伝子を不活化したdead Cas9 (dCas9)を応用し、DNA配列特異的にエピゲノム編集を誘導する手法が開発された。現在、植物ではDNA脱メチル化（TET1）とDNAメチル化（DRM2）の報告のみで、エピゲノム編集の報告例が少ない。これらに使用された植物エピゲノム編集用のベクターについてGatewayシステムを用いて目的遺伝子を挿入するため、シロイヌナズナのH3K27me3に関わる遺伝子（SWN, CLF, MEA）をpENTRベクターにクローニングした。ナズナ・タバコの葉で一過性発現をqRT-PCRで確認し、ChIP-PCRにより標的DNA領域のH3K27me3の変化を確認するため、H3K27me3に関わる遺伝子(SWN, CLF, MEA）を植物エピゲノム編集用ベクターにクローニングし、ベクターにマルチsgRNAの導入を進めた。最終的にはシロイヌナズナの形質転換体を作製し、花成への影響を確認する計画である。