Identification of maturation-related pheromones in marine fish and the application of pheromone substances to aquaculture

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21339
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 征矢野 清 長崎大学, 海洋未来イノベーション機構, 教授 (80260735)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 成熟関連フェロモン / 成熟関連ホルモン / 成熟誘導 / 種苗生産技術

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、これまで全く解明されていない海産魚の成熟関連フェロモンの同定と役割解明、ならびにフェロモンを用いた全く新しい発想の種苗生産技術の開発の基盤形成を目的とする。これまでに、ハタ類雌の成熟・排卵誘導には雄からのフェロモン（成熟関連フェロモン）が介在することを発見しているが、その物質は同定されていない。また、産生器官および運搬放出器官として、精巣、肝臓、腎臓が推定されているが、その詳細は明らかにされていない。2020年度は、フェロモンの放出経路として有力な尿に着目し、それに含まれる物質の同定に取り組んだ。研究開始時には成熟に関連する性ステロイドとその代謝物に焦点を絞り、メタボローム解析によって物質の絞り込みを進める予定であったが、メバルで成熟雄の尿に特異的なタンパク質（未同定）が確認されたことから、カンモンハタの雄の尿において、成熟雄に出現するタンパク質の検索を実施した。成熟雄より採取した尿（全尿）を可溶化処理し、質量分析によってタンパク質・ペプチドの同定を行った。また、電気泳動（SDS-PAGE）で確認された産卵時の雄に特有のタンパク質を抽出し、これをLC-MS解析に供した。その結果、成熟雄尿中に651種類のタンパク質を確認し、特に産卵時に出現するタンパク質としてパルブアルブミンを検出した。
また、成熟した雄は膀胱が発達することから、膀胱の形態学的変化についても合わせて検討しところ、雄の肥大した膀胱では尿が貯留される尿路の上皮が肥厚しており、加えて柔毛様の構造と分泌小胞が観察された。これらの特徴は雌の膀胱では観られないことから、雄の尿貯留および特異タンパク質の分泌との関連を想像させる。
ただし、コロナ感染拡大の影響を受け、県外への移動制限により実験魚の十分な採集ができず、手持ちの実験魚の範囲で分析等を実施せざるを得なかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2020年度は、カンモンハタを実験魚に用いて、成熟雄から放出され、雌の最終成熟から排卵までの生理現象を誘導するフェロモン物質の同定を目指した。フェロモンの同定は2年間かけて実施する予定としているが、本年度はコロナ感染拡大の影響を受け、十分な実験魚の確保が困難であったことから、尿に含まれ、成熟した雄に出現するタンパク質に焦点を絞って解析を実施した。その結果、600を超える尿中のタンパクから、成熟時に急増する複数のタンパク質を確認し、その一つとしてパルブアルブミンを同定した。合わせて性関連のステロイドについても解析の準備に入っており、使用できたサンプルは少ないながらも同定に向けて順調に研究を進めている。また、興味深いことに、雄の膀胱が産卵期に肥大するとともに、上皮細胞に形態変化が見られた。これは、フェロモンの分泌を理解するための新たな知見となりうるものであり、重要な成果である。また、飼育実験により、カンモンハタ以外のハタ科魚類（アカハタ）でも産卵時に雄雌間のコミュニケーションがあることを確認し、2021年の実験に向けた準備を進めることができた。このようなにコロナ禍ではあるものの、目的達成に向かって順調に研究は進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

本研究において最も使いやすい実験魚は、成熟時の情報が多く、フェロモンを介した雌雄間コミュニケーションの有無が確認されているカンモンハタである。2021年度は、産卵期に沖縄においてカンモンハタを捕獲し、実験魚として使用する予定である。2020年度の結果を元に、特異的なタンパク質の発現や分泌の解析を進める共に、尿中のステロイドの分析を実施する。ステロイドについては、尿あるいは精巣・肝臓・腎臓からステロイドを抽出し、C-18カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて分析する。しかし、コロナ感染拡大により国内移動の制限により、沖縄においてカンモンハタを捕獲することができない可能性もあることから、2020年度の試験において実験魚として活用できる可能性が高まったアカハタを用いた実験も実施する。しかし、同じハタ類ではあるものの、種により特異的に出現するタンパク質やステロイドが異なる可能性もあることから、慎重に解析を進める必要がある。
2020年度に明らかとなった膀胱の形態変化についても、成熟状況や雌雄の違いと関連づけて確認し、上皮細胞の変化が物質の貯留・分泌とどのように関わるかを明らかにする。特に、尿中のタンパク質が腎臓ではなく膀胱上皮より分泌される可能性もあることから、同定されたタンパク質との関連を中心に解析を進める。