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2020 Fiscal Year Research-status Report

Application of a viral vector to develop anti-poultry red mite vaccines targeting antigens expressed on the plasma membrane of midgut cells

Research Project

Project/Area Number 20K21357
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

村田 史郎  北海道大学, 獣医学研究院, 助教 (10579163)

Project Period (FY) 2020-07-30 – 2023-03-31
Keywordsワクモ / 外部寄生虫 / マレック病 / マレック病ウイルス / 組換えウイルス / 組換えワクチン / 弱毒生ワクチン / ウイルスベクター
Outline of Annual Research Achievements

ワクモ(鳥類の外部寄生虫)による吸血被害は、世界中の養鶏場で深刻な問題となっている。最近では薬剤に耐性を示すワクモの出現により、現行の薬剤による防除では制御が困難になりつつある。薬剤に変わる新規防除法としてワクチンが注目されている。本ワクチンは、ワクモの生理機能に重要な分子を抗原として免疫し、血液に含まれる抗体を吸血したワクモに致死的影響を与えることを作用機序とする。そのため腸管の細胞膜上に発現するタンパク質は最も影響を受けやすいと考えられ、これまでに腸管細胞の細胞膜上に発現が予想される分子を複数同定してきた。しかしそれらの多くは、複数回膜貫通型の分子や、大きな細胞膜領域を持つ分子であり、組換えタンパク質の作製には困難が予想され、ワクチン抗原としての利用には工夫が必要とされる。そこで本研究では、ウイルスベクターを用いて、ワクチン抗原を組換えウイルス感染細胞に細胞膜タンパク質として発現させることで、ワクチン効果に有効な免疫応答を誘導すること目的とした。本年度は組換えウイルスゲノムに挿入するためのワクチン抗原の選抜を行った。以前に実施したRNA sequencingのデータより、細胞膜上に発現が予想される分子を抽出し、本研究の趣旨に合致する、組換えタンパク質としての発現に困難が予想される立体構造を持つ抗原を選抜した。複数の抗原候補の中において、細胞膜上に発現が予想されるadipocyte plasma membrane-associated protein (APMAP) は、一回膜貫通型の大きな細胞外領域を持つ構造であると予想された。また、APMAPは腸管に発現することを確認することができた。そのためAPMAPは腸管細胞の細胞膜上に発現が予想されることから、APMAPを組換えウイルスゲノムに挿入する抗原として用いることとした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は組換えタンパク質の作製が困難な細胞膜タンパク質で、その応用には工夫が必要となるワクチン抗原について、ウイルスバクターを用いることで感染細胞上に細胞膜タンパク質として発現させ、ワクチン効果に有効な免疫応答を誘導すること目的としている。本年度は、細胞膜上に発現が予想される分子の中で、本研究の趣旨に合致する組換えタンパク質としての発現に困難が予想される、特徴的な立体構造を持つワクチン抗原の選抜を行った。以前に実施したRNA-sequencing解析より得られたデータを用いて、細胞膜上に発現が予想され、さらにワクチン効果が期待できるワクモの代謝や発育に重要な役割を持つと考えられる抗原を抽出した。これら抗原候補のうち、組換えタンパク質としての発現に困難が予想される構造を持つ3つの分子を対象抗原候補とした。抗原候補として、複数膜貫通型であるATP binding cassette (ABC)-Gトランスポーター、大きな細胞外領域を持つlow density lipoprotein (LDL) レセプターおよびadipocyte plasma membrane-associated protein(APMAP)を選抜した。各候補分子の発現強度を調べたところ、いずれも膜発現タンパク質の中では高値を示した。次に腸管における発現を検討するため、laser capture microdissectionにより中腸、卵巣、唾液腺の組織片を回収し、RT-PCRにより各組織における発現を解析した。その結果、ABC-GとLDLレセプターは、卵巣に発現していたが、中腸における発現は確認されなかった。一方で、APMAPは中腸と卵巣に発現が認められた。そのため、本研究におけるワクチン抗原候補として、大きな細胞外領域を持ち、腸管に発現するAPMAPを用い、組換えウイルスを作製することとした。

Strategy for Future Research Activity

今後はウイルスベクターを用いたAPMAP挿入組換えウイルスの作製を行い、鶏に免疫を行ったうえで抗ワクモ効果について検討を行う。ウイルスベクターとしては、マレック病ウイルス(MDV)の弱毒生ワクチンを用いる。まず、APMAP遺伝子をMDV弱毒株ゲノムに挿入した感染性クローンプラスミドを作製する。APMAPのC末端側にエピトープタグを付加した発現プラスミドを作製した後に、組換えに必要な相同配列を含むシャトルプラスミドを作製する。En passant mutagenesis法により弱毒MDVゲノムにAPMAP遺伝子を挿入した後に、挿入部位や変異の有無について、PCR、RFLPおよび塩基配列解析により確認する。得られた感染性クローンプラスミドよりAPMAP挿入組換えMDVを再構成し、in vitroにおけるウイルス性状を解析する。元株との増殖能をqPCRにより比較し、ウェスタンブロットによる感染細胞におけるAPMAPの発現、さらに膜上におけるAPMAPの発現をフローサイトメトリーにより検討する。次にAPMAP挿入組換えMDVを初生ヒナに免疫し、MD予防効果および抗ワクモ効果を検証する。MD発症予防効果については、免疫後にMDV強毒株を接種し、臨床症状や腫瘍形成率より評価を行う。抗ワクモ効果については、観察期間終了後に免疫鶏より血漿を回収し、人工吸血装置を用いて免疫血漿をワクモに吸血させ、死亡率と繁殖効率における影響を解析することで評価する。また、免疫血漿中におけるAPMAPに対する抗体価測定や特異抗体の産生について、ELISAおよびウェスタンブロットにより検討する。以上より、組換えタンパク質としての発現が困難な構造を持つ膜タンパク質のワクチン抗原としての応用について検討する。

Causes of Carryover

(理由) 今年度は本研究で用いるワクチン抗原候補の探索を行った。探索を行った抗原候補のうち、APMAPが本研究に適していると考えられるため、APMAPを基軸として本研究を進める予定である。しかし、APMAPとは異なる特徴的な構造を持つ膜発現タンパク質への応用の可能性を広げるために、次年度以降も継続的に抗原検索を行うこととした。そのために必要な経費として、一般試薬・消耗品、分子生物学用試薬、シークエンス用試薬の一部を次年度の仕様とした。
(使用計画) 引き続き本研究に適した抗原検索を継続的に行うために、次年度使用額のうち、約20万円については一般試薬・消耗品、25万円については分子生物学用試薬、22万円についてはシークエンス用試薬に使用する。

  • Research Products

    (22 results)

All 2021 2020

All Journal Article (19 results) (of which Peer Reviewed: 19 results,  Open Access: 12 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Selection of reference genes for quantitative PCR analysis in poultry red mite (<i>Dermanyssus gallinae</i>)2021

    • Author(s)
      Ariizuim, T., Murata, S., Fujisawa, S., Isezaki, M., Maekawa, N., Okagawa, T., Sato, T., Oishi, E., Taneno, A., Konnai, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Journal of Veterinary Medical Science

      Volume: 83 Pages: 558~565

    • DOI

      10.1292/jvms.20-0677

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Characterisation of a cysteine protease from poultry red mites and its potential use as a vaccine for chickens2021

    • Author(s)
      Murata, S., Taniguchi, A., Isezaki, M., Fujisawa, S., Sakai, E., Taneno, A., Ichii, O., Ito, T., Maekawa, N., Okagawa, T., Konnai, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Parasite

      Volume: 28 Pages: 9

    • DOI

      10.1051/parasite/2021005

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] PD-L1 immunohistochemistry for canine cancers and clinical benefit of anti-PD-L1 antibody in dogs with pulmonary metastatic oral malignant melanoma2021

    • Author(s)
      Maekawa, N., Konnai, S., Nishimura, M., Kagawa, Y., Takagi, S., Hosoya, K., Ohta, H., Kim, S., Okagawa, T., Izumi, Y., Deguchi, T., Kato, Y., Yamamoto, S., Yamamoto, K., Toda, M., Nakajima, C., Suzuki, Y., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      npj Precision Oncology

      Volume: 5 Pages: 10

    • DOI

      10.1038/s41698-021-00147-6

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] The enhancement of Th1 immune response by anti-PD-L1 antibody in cattle infected with <i>Mycobacterium avium</i> subsp. <i>paratuberculosis</i>2021

    • Author(s)
      Sajiki, Y., Konnai, S., Nagata, R., Kawaji, S., Nakamura, H., Fujisawa, S., Okagawa, T., Mawkawa, N., Kato, Y., Suzuki, Y., Murata, S., Mori, Y., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Journal of Veterinary Medical Science

      Volume: 83 Pages: 162~166

    • DOI

      10.1292/jvms.20-0590

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Direct evidence of the preventive effect of milk replacer?based probiotic feeding in calves against severe diarrhea2021

    • Author(s)
      Kayasaki, F., Okagawa, T., Konnai, S., Kohara, J., Sajiki, Y., Watari, K., Ganbaatar, O., Goto, S., Nakamura, H., Shimakura, H., Minato, E., Kobayashi, A., Kubota, M., Terasaki, N., Takeda, A., Noda, H., Honma, M., Maekawa, N., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Veterinary Microbiology

      Volume: 254 Pages: 108976

    • DOI

      10.1016/j.vetmic.2020.108976

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tick saliva-induced programmed death-1 and PD-ligand 1 and its related host immunosuppression2021

    • Author(s)
      Sajiki, Y., Konnai, S., Ikenaka, Y., Gulay, K. C. M., Kobayashi, A. Parizi, L. F., Joo, B. C., Watari, K., Fujisawa, S., Okagawa, T., Maekawa, N., Logullo, C.,da Silva Vaz, I.,Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 11 Pages: 1063

    • DOI

      10.1038/s41598-020-80251-y

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] A TLR7 agonist activates bovine Th1 response and exerts antiviral activity against bovine leukemia virus2021

    • Author(s)
      Sajiki, Y., Konnai, S., Okagawa, T., Maekawa, N., Nakamura, H., Kato, Y., Suzuki, Y., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Developmental & Comparative Immunology

      Volume: 114 Pages: 103847

    • DOI

      10.1016/j.dci.2020.103847

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Molecular detection and genetic characterization of infectious laryngotracheitis virus in poultry in Myanmar2020

    • Author(s)
      Yang, Z., Murata, S., Fujisawa, S., Takehara, M., Katakura, Ken., Hmoon, M. M., Win, S. Y., Bawm, S., Konnai, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      BMC Veterinary Research

      Volume: 16 Pages: 453

    • DOI

      10.1186/s12917-020-02666-z

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Distinct polymorphisms in a single herpesvirus gene are capable of enhancing virulence and mediating vaccinal resistance2020

    • Author(s)
      Conradie, A. M., Bertzbach, L. D., Trimpert, J., Patria, J. N., Murata, S., Parcells M. S.,Kaufer, B. B.
    • Journal Title

      PLOS Pathogens

      Volume: 16 Pages: e1009104

    • DOI

      10.1371/journal.ppat.1009104

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Genetic characterization of a Marek’s disease virus strain isolated in Japan2020

    • Author(s)
      Murata, S., Machida, Y., Isezaki, M., Maekawa, N., Okagawa, T., Konnai, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Virology Journal

      Volume: 17 Pages: 186

    • DOI

      10.1186/s12985-020-01456-1

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Detection and molecular identification of Leucocytozoon and Plasmodium species from village chickens in different areas of Myanmar2020

    • Author(s)
      Win, S. Y., Chel, H. M., Hmoon, M. M., Htun, L. L., Bawm, S., Win, M. M., Murata, S., Nonaka, N., Nakao, R., Katakura, K.
    • Journal Title

      Acta Tropica

      Volume: 212 Pages: 105719

    • DOI

      10.1016/j.actatropica.2020.105719

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Transcriptome dynamics of blood-fed and starved poultry red mites, Dermanyssus gallinae2020

    • Author(s)
      Fujisawa, S., Murata, S., Isezaki, M., Oishi, E., Taneno, A., Maekawa, N., Okagawa, T., Konnai, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Parasitology International

      Volume: 78 Pages: 102156

    • DOI

      10.1016/j.parint.2020.102156

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Enhanced Immunotherapeutic Efficacy of Anti-PD-L1 Antibody in Combination with an EP4 Antagonist2020

    • Author(s)
      Sajiki, Y., Konnai, S., Cai, Z., Takada, K., Okagawa, T., Maekawa, N., Fujisawa, S., Kato, Y., Suzuki, Y., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      ImmunoHorizons

      Volume: 4 Pages: 837~850

    • DOI

      10.4049/immunohorizons.2000089

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The Suppression of Th1 Response by Inducing TGF-β1 From Regulatory T Cells in Bovine Mycoplasmosis2020

    • Author(s)
      Sajiki, Y., Konnai, S., Goto, S., Okagawa, T., Ohira, K., Shimakura, H., Maekawa, N., Gondaira, S., Higuchi, H., Tajima, M., Hirano, Y., Kohara, J., Murata, S., Ohashi K.
    • Journal Title

      Frontiers in Veterinary Science

      Volume: 7 Pages: 609443

    • DOI

      10.3389/fvets.2020.609443

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] PD-L1 expression in equine malignant melanoma and functional effects of PD-L1 blockade2020

    • Author(s)
      Ganbaatar, O., Konnai, S. Okagawa, T., Nojima, Y., Maekawa, N., Minato, E., Kobayashi, A., Ando, R., Sasaki, N., Miyakoshi, D., Ichii, O., Kato, Y., Suzuki, Y., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 15 Pages: e0234218

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0234218

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Identification and functional analysis of ferritin 2 from the Taiga tick Ixodes persulcatus Schulze2020

    • Author(s)
      Githaka, N. W., Konnai, S., Isezaki, M., Goto, S., Xavier, M. A., Fujisawa, S., Yamada, S., Okagawa, T., Maekawa, N., Logullo, C., da Silva Vaz, I., Murata, S., Ohashi, K. 4.巻 11
    • Journal Title

      Ticks and Tick-borne Diseases

      Volume: 11 Pages: 101547

    • DOI

      10.1016/j.ttbdis.2020.101547

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Expression Analysis of Canine CMTM6 and CMTM4 as Potential Regulators of the PD-L1 Protein in Canine Cancers2020

    • Author(s)
      Takeuchi, H., Konnai, S., Maekawa, N., Minato, E., Ichikawa, Y., Kobayashi, A., Okagawa, T., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Frontiers in Veterinary Science

      Volume: 7 Pages: 330

    • DOI

      10.3389/fvets.2020.00330

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Upregulation of PD-L1 Expression by Prostaglandin E2 and the Enhancement of IFN-γ by Anti-PD-L1 Antibody Combined With a COX-2 Inhibitor in Mycoplasma bovis Infection2020

    • Author(s)
      Goto, S., Konnai, S., Hirano, Y., Kohara, J., Okagawa, T., Maekawa, N., Sajiki, Y., Watari, K., Minato, E., Kobayashi, A., Gondaira, S., Higuchi, H., Koiwa, M., Tajima, M., Taguchi, E., Uemura, R., Yamada, S., Kaneko, M. K., Kato, Y., Yamamoto, K., Toda, M., Suzuki, Y., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Frontiers in Veterinary Science

      Volume: 7 Pages: 12

    • DOI

      10.3389/fvets.2020.00012

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Immunosuppressive effects of sialostatin L1 and L2 isolated from the taiga tick Ixodes persulcatus Schulze2020

    • Author(s)
      Sajiki, Y., Konnai, S., Ochi, A., Okagawa, T., Githaka, N., Isezaki, M., Yamada, S., Ito, T., Ando, S., Kawabata, H., Logullo, C., da Silva Vaz, I., Maekawa, N., Murata, S., Ohashi, K.
    • Journal Title

      Ticks and Tick-borne Diseases

      Volume: 11 Pages: 101332

    • DOI

      10.1016/j.ttbdis.2019.101332

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 牛白血病ウイルス感染症における免疫抑制受容体TIM-3の発現解析および機能解析2020

    • Author(s)
      中村 隼人, 今内 覚, 岡川 朋弘, 佐治木 大和, 渡 慧, 神谷 可菜, 齋藤 麻矢, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
    • Organizer
      第163回日本獣医学会学術集会
  • [Presentation] ネコCytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) を標的とした新規免疫抑制製剤の開発における基礎的検討2020

    • Author(s)
      大塚 拓海, 今内 覚, 前川 直也, 渡 慧, 岡川 朋弘, 村田 史郎, 大橋 和彦
    • Organizer
      第163回日本獣医学会学術集会
  • [Presentation] ワクモにおける定量的PCR法確立のための内在性コントロール遺伝子の探索2020

    • Author(s)
      有泉 拓馬, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 伊勢崎 政美, 前川 直也, 岡川 朋弘, 種子野 章, 大石 英司, 今内 覚, 大橋 和彦
    • Organizer
      第163回日本獣医学会学術集会

URL: 

Published: 2021-12-27  

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