2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of sodium-selective optogenetic tools for super-precise optical neural manipulation
| Project/Area Number |
20K21383
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
井上 圭一 東京大学, 物性研究所, 准教授 (90467001)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
|
| Keywords | ロドプシン / レチナール / オプトジェネティクス / ナトリウムポンプ / ヘリオロドプシン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、Na+のみを高効率で細胞内へ輸送する、細胞内pHの変化など副次効果のない次世代のオプトジェネティクスツールとしての応用が期待される、新たなロドプシンの開発を行う。そのため、2018年に研究代表者の井上らが見出した、既存のロドプシンと膜内での配向が逆転したヘリオロドプシン（HeR）の構造を参考に、外向きナトリウムポンプ型ロドプシン（NaR）の細胞質側および細胞外側表面のアミノ酸の電荷バランスを変えることでタンパク質の配向を逆転し、内向きNa+ポンプへと機能転換することを目標とする。
2020年度は、まず研究協力者の古賀（分子研）によって、BEdep_AAProf法を用いてHeRと同様の位置に、正電荷を持つアルギニンやリジン残基を導入したNaRの配列を多数デザインした。そしてTOPCONSやPhiliusなどを用いて、配向性を評価したところ、細胞膜中での配向の反転が期待される分子が見出された。
そこでその結果をもとに井上らがNaRの変異体の作製を行った。まずBEdep_AAProf法で提案された変異を全て導入した変異体を作製したが、その場合大腸菌中でNaRの発現が大きく阻害される結果となった。そこでボトムアップ的にポイントミューテーションを重ねていく形で、変異体の構築を進めることとした。その結果各位置の変異を1つずつ導入する場合においては、タンパク質の発現量に大きな変化がないことが示され、さらに変異数を増やして５重変異体まで作製を進めることができた。一方、全変異からひとつずつ変異数を減らすアプローチにおいては、10重変異体では弱いながら、タンパク質の発現が確認された。
これらの分子は野生型NaRと比べ、細胞膜内での分子配向の変化が期待されることから、次年度以降において実験的に配向を評価するとともに、配向の変化が見られたものについてはイオン輸送活性の評価を行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度は、まず研究協力者の古賀（分子研）によって、BEdep_AAProf法を用いて、HeRと同様の位置に、正電荷を持つアルギニンやリジン残基を導入したNaRの配列を多数デザインした。そしてTOPCONSやPhiliusなどを用いて、配向性を評価したところ、細胞膜中での配向の反転が期待される分子が見出された。この分子では19か所のアミノ酸の電荷バランスが変化し、特にN末端側表面が正に帯電したものであった。
続いて上記の結果をもとに井上らがNaRの変異体の作製を行った。まずBEdep_AAProf法で提案された19か所の変異を全て導入した変異体を作製したが、その場合大腸菌中でNaRの発現が大きく阻害される結果となった。そこでボトムアップ的にポイントミューテーションを重ねていく形で、変異体の構築を進めることとした。その結果19か所の変異を1つずつ導入する場合においては、タンパク質の発現量に大きな変化がないことが示され、さらに変異数を増やしていった結果、野生型とほぼ変わらないレベルの発現を示す５重変異体を７種類得ることに成功した。一方、全変異からひとつずつ変異数を減らすアプローチにおいては、10重変異体では弱いながら、タンパク質の発現が確認された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度作製を行った７種類の５重変異体と１種類の10重変異体は、野生型NaRと比べ細胞膜内での分子配向の変化が期待されることから、次年度以降において実験的に配向を評価する。そして実際に配向の変化が見られたものについてはイオン輸送活性の評価を行い、内向きNa+ポンプとして機能する分子を探索する。いずれの分子も良好な反転が見られなかった場合には、さらなるアミノ酸変異の最適化を試みる。
|
-
-
[Journal Article] Exploration of Natural Red-shifted Rhodopsins Using a Machine Learning-based Bayesian Experimental Design2021
Author(s)
Keiichi Inoue, Masayuki Karasuyama, Ryoko Nakamura, Masae Konno, Daichi Yamada, Kentaro Mannen, Takashi Nagata, Yu Inatsu, Hiromu Yawo, Kei Yura, Oded Beja, Hideki Kandori, Ichiro Takeuchi
-
Journal Title
Communications Biology
Volume: 4
Pages: 362
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
[Journal Article] Time-Resolved Serial Femtosecond Crystallography Reveals Early Structural Changes in Channelrhodopsin2021
Author(s)
K. Oda, T. Nomura, T. Nakane, K. Inoue, S. Ito, J. Vierock, ... R. Ishitani, S. Hayashi, H. Kandori, P. Hegemann, S. Iwata, M. Kubo, T. Nishizawa, O. Nureki
-
Journal Title
eLife
Volume: 10
Pages: e62389
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
-
[Journal Article] Schizorhodopsins: A Novel Family of Rhodopsins from Asgard archaea that Function as Light-Driven Inward H+ Pumps2020
Author(s)
Keiichi Inoue, Satoshi P. Tsunoda, Manish Singh, Sahoko Tomida, Shoko Hososhima, Masae Konno, Ryoko Nakamura, Hiroki Watanabe, Paul-Adrian Bulzu, Horia L. Banciu, Adrian-Stefan Andrei, Takayuki Uchihashi, Rohit Ghai, Oded Beja, Hideki Kandori
-
Journal Title
Science Advances
Volume: 6
Pages: eaaz2441
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] 第58回日本生物物理学会年会2020
Author(s)
長坂 勇次郎、細島 頌子、神取 秀樹、井上 圭一、八尾 寛
Organizer
The gate-keeper role of a highly conserved helix-3 tryptophan for ion transport of the channelrhodopsin chimera, C1C2/ChRWR
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
