2020 Fiscal Year Research-status Report
遺伝暗号改変による新規超高感度タンパク質NMR測定法の創製
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20K21402
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
河野 俊之 北里大学, 医学部, 教授 (40416657)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | タンパク質NMR / 無細胞タンパク質合成 / 安定同位体標識 / 超高感度 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
この研究の目的は、10 μg 以下かつ 1 μM 程度の濃度で迅速なNMR解析を可能にし、タンパク質NMR解析のブレークスルーをもたらすことであり、そのために現在最も感度良くNMRが測定できるロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、バリン(Val)、メチオニン(Met)のメチル基に注目し、そのメチル基の13C NMRシグナルをこれまでに無いほどの高感度で簡便に帰属する方法を創製することである。タンパク質のメチル基のNMRシグナルはわずか 1 μM のタンパク質濃度で観測可能であるが、そのシグナルそれぞれがどの残基に属するものかの帰属を行うためには、1 mM 程度の濃度の試料と長時間の３次元NMR測定が必要であり、その方法もメチオニンのメチル基には原理的に適用困難である。そこで、メチオニンも含めた４種類のアミノ酸のメチル基のNMRシグナルの帰属を1 μM で行える技術の開発に着手した。
今年度は、ターゲットとなる目的タンパク質を２種類設定し、それぞれについて、Leu、Ile、Valの各残基について、残基番号選択的な安定同位体標識を可能にするために注目する残基に対応するコドンをminorコドンに対応に変換し、そのたの残基をmajorコドンに変換した変異体群を数十種類作成した。またMetについてはIleの全ての残基のコドンをmajorコドンに変換しMetの注目する残基に対応するコドンをIleのminorコドンに変換した変異体群を全てのMet残基に対して作成した。
また、無細胞タンパク質合成で必要となるロイシルtRNA合成酵素(LeuRS)、IleRS、ValRS、MetRS、EF-Tu、イソロイシンtRNA修飾酵素（TilS）、EF-Tuなどの酵素群の遺伝子クローニングおよび大量発現系の構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２年間の研究実施計画においてちょうど半分程度研究が進んだため。
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| Strategy for Future Research Activity |
クローニングと大量発現系の構築が完了したLeuRS、IleRS、ValRS、MetRS、EF-Tu、イソロイシンtRNA修飾酵素（TilS）、EF-Tuなどの酵素群について、実際にタンパク質を大量発現させ、精製を行う。またロイシンtRNA（tRNALeu）、tRNAIle、tRNAVal、tRNAMetなど各種tRNAの遺伝子をDNA合成で作成し、RNAポリメラーゼで大量に転写・合成する系を構築する。
これらの材料が準備でき次第、minorコドンに対応するtRNAに13Cで安定同位体標識されたアミノ酸を結合させmajorコドンに対応するtRNAに非標識のアミノ酸を結合させたものを無細胞タンパク質合成系に加えることで、着目するアミノ酸残基だけに13Cの安定同位体標識を導入する。これらを、今年度作成したターゲットタンパク質の変異体群に順次導入し、実際に1H-13C相関スペクトルの測定を行って安定同位体標識を導入したアミノ酸残基由来のNMRシグナルだけを観測し、NMRシグナルの帰属を順次試みる。
Metについては、コドン振り分け法が適用できないので、未修飾のIle のminor tRNAにMetRSを用いて13Cで安定同位体標識されたMetを付加した後にTilSを用いてアンチコドン１字目をリシジンに修飾することで、AUAコドンの位置だけに13C標識されたMetを導入する。この方法を用い、コドン振り分け法と同様の方法を用いてMetの残基番号選択的な13C安定同位体標識を行い、実際に1H-13C相関スペクトルの測定で安定同位体標識を導入したアミノ酸残基由来のNMRシグナルだけを観測することでNMRシグナルの帰属を行う。
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| Causes of Carryover |
挑戦的研究（萌芽）は、７月末に交付内定通知を受け、その時点から実験補助の研究協力者の募集を開始したため、完全な研究体制が構築できたのが１０月となってしまった。１０月以降は順調に研究が進行しているが、研究開始が遅れた分が次年度使用額となっている。次年度は研究開始の遅れを取り戻し、２０２２年３月までに助成金を有効に活用して研究実施計画を達成する予定である。
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