遺伝暗号改変による新規超高感度タンパク質NMR測定法の創製

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21402
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 河野 俊之 北里大学, 医学部, 教授 (40416657)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: タンパク質NMR / 無細胞タンパク質合成 / 安定同位体標識 / 超高感度

Outline of Annual Research Achievements

この研究の目的は、10 μg 以下かつ 1 μM 程度の濃度で迅速なNMR解析を可能にし、タンパク質NMR解析のブレークスルーをもたらすことであり、そのために現在最も感度良くNMRが測定できるロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、バリン(Val)、メチオニン(Met)のメチル基に注目し、そのメチル基の13C NMRシグナルをこれまでに無いほどの高感度で簡便に帰属する方法を創製することである。タンパク質のメチル基のNMRシグナルはわずか 1 μM のタンパク質濃度で観測可能であるが、そのシグナルそれぞれがどの残基に属するものかの帰属を行うためには、1 mM 程度の濃度の試料と長時間の３次元NMR測定が必要であり、その方法もメチオニンのメチル基には原理的に適用困難である。そこで、メチオニンも含めた４種類のアミノ酸のメチル基のNMRシグナルの帰属を1 μM で行える技術の開発に着手した。
今年度は、FKBPタンパク質をモデルタンパク質とし、実際に残基番号選択的安定同位体標識を開始した。FKBPタンパク質に含まれる３カ所のメチオニン残基に対してそれぞれ選択的安定同位体標識を行い、メチオニン残基のシグナルが１残基分だけ出現することを1H-15N HSQCおよび1H-13C HSQCスペクトルの測定で確認した。また、イソロイシン残基４カ所についてもそれぞれ選択的安定同位体標識を行ったところ、イソロイシン残基のシグナルが１残基分だけ出現することを1H-15N HSQCおよび1H-13C HSQCスペクトルの測定で確認した。これらの結果よりメチオニン残基とイソロイシン残基については、低濃度でのメチル基シグナルのNMRシグナルの帰属を行う技術を確立できたことがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

メチオニン残基、およびイソロイシン残基について残基番号選択的な安定同位体標識の方法論確立ができたため。

Strategy for Future Research Activity

残りのロイシン残基、バリン残基についても残基番号選択的な安定同位体標識の方法論確立を目指す。

Causes of Carryover

コロナ禍において、試薬や物品の調達に遅れが生じたため、2021年度中に全ての計画を完了することができなかった。次年度使用額を有効に活用し、研究計画を着実に遂行していきたい。