2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K21408
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
大竹 史明 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 特任准教授 (60447373)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | ユビキチン / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチン修飾は生体に必須の翻訳後修飾であり、タンパク質恒常性（プロテオスタシス）維持やシグナル伝達、DNA修復など、多種多様な生命現象を制御している。ユビキチンは76アミノ酸からなる小型タンパク質であり、カルボキシ（C）末端グリシンを介して基質タンパク質のリジン残基に翻訳後修飾として付加され、基質タンパク質の運命や機能を変換する。しかし、ユビキチンの機能的多様性はいまだ十分には解明されていない。そこで本研究は、ユビキチンの新たな機能の解明を目的とする。ユビキチンの新機能を明らかにするため、細胞内ユビキチンのプロテオフォームを明らかにすべく、インタクトなタンパク質の質量分析法であるトップダウンプロテオミクス解析法を構築した。まずLiquid chromatography (LC)による分離に関しては、ユビキチンは約8.6kDであり、C18カラムで分離・測定可能であることが明らかとなった。さらにMS2による検出に関しては、Higher energy Collision Dissociation (HCD)による開裂によって特徴的なb, yイオンが検出され、特異的なMS2スペクトルが得られることが明らかとなり、トップダウン解析を確立した。次に、細胞から遊離型モノユビキチンの精製法を確立した。モノユビキチンのトップダウン解析により、切断型ユビキチンの存在比を定量することができた。さらに、細胞種や分画の差異による切断型ユビキチンの存在量についても検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ユビキチンのトップダウン質量分析を確立し、細胞から精製したユビキチンの解析に成功しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ユビキチンのプロテオフォームをさらに網羅的・定量的に解析し、切断型ユビキチンに関連する細胞内経路を解明していく。
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| Causes of Carryover |
ユビキチンのトップダウン質量分析解析には、過去のトップダウン法に関する文献調査をふまえて、C8カラムあるいはモノリスカラムなど様々な分離方法を試行錯誤する必要があることが想定されていたが、C18カラムで予想以上に良好な分離解析に成功した。そのため本年度の使用額にて研究を十分に遂行できた。しかし今後、関連因子の遺伝子ノックダウンや抗体購入などで高額の試薬代が必要になると予想されるため、次年度はこれら解析に必須の消耗品に充てる予定である。
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