2021 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
20K21409
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
宮岡 佑一郎 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, プロジェクトリーダー (20549521)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
|
| Keywords | ゲノム編集 / １細胞 / HR / NHEJ / Cas9 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集技術は様々な遺伝的改変を生じるが、従来のゲノム編集結果解析手法は、細胞を集団で扱うものがほとんどであり、個々の細胞で起きる編集結果を把握することができない。そこで本研究では、高精度自動1細胞分注装置であるSPiSを用いて、ゲノム編集を実施した細胞を単離し、1細胞由来のクローンを多数解析することを目指した。
昨年度までにSPiSによる1細胞由来クローン樹立の最適化、および得られたクローンのゲノム編集結果の次世代シークエンス解析系確立までを終えた。そこで、今年度はHEK293T、HeLa、PC9細胞の３種類の細胞に、RBM20 R636S、GRN R493X、ATP7B R778Lの３種類の点変異をそれぞれ導入するゲノム編集を実施し、その編集結果を得られたクローンごとに解析した。
まず、HEK293T細胞にCas9を用いてRBM20 R636S変異を導入したところ、HR効率が非常に低かった。そこで私達がHR活性が高いことを見出した、Cas9の改変体であるHypaCas9を用いたところ、Cas9に比較して約10倍の変異導入効率が得られた。HEK293T細胞のHypaCas9によるRBM20 R636S変異導入結果を、各クローンで観察したところ、全ての標的アリルがHRもしくはNHEJで編集されている細胞と、HypaCas9が発現したにも関わらず、ゲノム編集が全く起きない細胞に二極化していることが明らかとなった。また、細胞内の全ての標的アリルがHRで編集される確率も高いことが明らかとなった。合計2600以上のクローンを解析した結果、同様の傾向が、HeLa、PC9細胞でもGRN R493X、ATP7B R778L変異導入でも観察された。
したがって私達は、ゲノム編集は個々の細胞で、全ての標的アリルで起きるか、全く起きないかの二者択一性を持つことを明らかにした。
|
-
-
-
[Journal Article] Gain-of-function cardiomyopathic mutations in RBM20 rewire splicing regulation and re-distribute ribonucleoprotein granules within processing bodies2021
Author(s)
Fenix AM, Miyaoka Y, Bertero A, Blue SM, Spindler MJ, Tan KKB, Perez-Bermejo JA, Chan AH, Mayerl SJ, Nguyen TD, Russell CR, Lizarraga PP, Truong A, So PL, Kulkarni A, Chetal K, Sathe S, Sniadecki NJ, Yeo GW, Murry CE, Conklin BR, Salomonis N.
-
Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: 6324
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
-
-
[Presentation] Retinoids rescue ceruloplasmin secretion and alleviate oxidative stress in steatosis models of Wilson’s disease-specific hepatocytes.2021
Author(s)
Dan Song, Gou Takahashi, Yun-Wen Zheng, Mami Matsuo-Takasaki, Jingyue Li, Miho Takami, Yuri An, Yasuko Hemmi, Natsumi Miharada, Tsuyoshi Fujioka, Michiya Noguchi, Takashi Nakajima, Megumu K Saito, Yukio Nakamura, Tatsuya Oda, Yuichiro Miyaoka, Yohei Hayashi
Organizer
Cold Spring Harbor-Asia, Liver Development, Metabolism, Disease & Cancer Meeting
Int'l Joint Research
-
-
-
-
-
-
-
-
-
