2020 Fiscal Year Research-status Report
Searching for cytosolic function of PPR proteins
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20K21427
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
竹中 瑞樹 京都大学, 理学研究科, 准教授 (10796163)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | PPRタンパク質 / RNA結合タンパク質 / 植物オルガネラ / 転写後調節 / 転写開始点選択 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
PPRタンパク質は35アミノ酸からなるRNA結合モジュールを繰り返し持ち、配列特異的にRNAと結合する。陸上植物ゲノムに数百個コードされているPPRタンパク質のほとんどはミトコンドリアや葉緑体などのオルガネラでRNAの転写、修飾、安定化、編集、翻訳など様々な転写後調節に関わっている。そのため、これまでPPRタンパク質はオルガネラに特化したRNA結合タンパク質だと考えられてきた。最近の研究により、赤色光シグナルによる転写開始点変化によってN末端側のシグナル配列を失い、細胞質に局在する短鎖PPRタンパク質が多数存在する可能性が示唆され た。これらの短鎖PPRタンパク質はその構造上、細胞質でもRNA結合能を保持している可能性が高い。
これまでにいつくかのPPRタンパク質が実際に細胞質に存在することをGFP融合タンパク質による細胞内局在観察により明らかにした。現在オルガネラに存在する長鎖バージョン、主に細胞質に局在する短鎖バージョンのPPRタンパク質をそれぞれクローニングしている。これらを植物内で発現させることにより、異なる長さのPPRタンパク質の機能の違いを明らかにする。
本研究で はPPRタンパク質の細胞質での隠れた機能を探索することを目的とする。PPRタンパク質は植物最大の遺伝子ファミリーを形成するRNA結合タンパク質である。このPPR タンパク質が細胞質で核コード遺伝子の転写後調節に関わるとすれば、植物のRNA調節の重大なパラダイム・シフトになるであろう。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1)赤色光依存的に転写開始点が変化し、それによってN末端 の配列が変化するとされたPPRタンパク質遺伝子について、その転写開始点を5‘RACE法により確認している。中にはこの手法では未だに確認できていない転写開始点も存在する。
2)それぞれの転写開始点から転写されたmRNAより合成される長短のタンパク質それぞれとGFP融合タンパク質を過剰発現させるコンストラ クトを作成した。蛍光顕微鏡により細胞内局在の解析を行っている。
3)各PPRタンパク質遺伝子のシロイヌナズナノックアウト株に、長鎖または短鎖PPRのGFP融合タンパク質を過剰発現させた株の作成を開始している。
4）短鎖PPRタンパク質の標的RNAをプログラムで予測した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）引き続き5’RACE法により転写開始点の確認をすすめる。
2）それぞれの転写開始点から転写されたmRNAより合成される長短のタンパク質のクローニング、形質転換を終了させ、その細胞内局在解析をすすめる。
3)変異体が致死である候補PPRタンパク質が多いことが明らかになってきた。この場合野生株に長鎖、短鎖PPRタンパク質を発現させた形質転換体を用いて解析を行う方針である。
4)短鎖PPRタンパク質の標的RNAをプログラムで予測したが、候補が絞りきれておらず、実験的手法による解析が不可欠である。GFP融合タンパク質を発現させた形質転換体を用いて、ChiP-SeqによるRNA標的の同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
COVID19による研究活動の制限により、人件費の行使および実験計画が遅れている。また国際学会の予定なども延期されたものが多いため翌年使用分として活用する。
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