Microbial individual ecology based on cell isolation and observation

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21455
• Research Institution: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
• Principal Investigator: 横川 太一 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 超先鋭研究開発部門(超先鋭研究プログラム), 研究員 (00402751)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 張 翼 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 超先鋭研究開発部門(超先鋭研究プログラム), 副主任研究員 (40795358)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 細菌個体隔離技術 / 細菌個体生態学 / 微生物生態学

Outline of Annual Research Achievements

本課題では、「細菌個体の生理活性ダイナミクスが、群集レベルでの機能に波及する機構」を明らかにするために、「細菌群集の中の個体(1細胞)の形質」の測定方法の確立を目的に研究を進めている。細菌個体隔離技術として、超微小液滴作製デバイス[フェムトリッター・ドロップレット・アレイ(Femtoliter droplet array, FemDA)]を使用した。これは、1cm角の薄板ガラスに微細加工技術を用いて30fLの容器を100万個整列したものである。実験から、FemDAに細 菌懸濁試料を注入すると一細菌個体(一細胞)が一つの容器ごとに分配されることが再現された。
令和3年度は、FemDAを用いて隔離した細菌細胞の性状測定のための、デバイス改良とデータ検証を行った。個体性状（細胞サイズ、形状）により隔離・捕集効率が大きく異なることが確認できた。細菌個体性状による捕集効率のバラツキ補正（捕集効率向上および均一化）のために、FemDAのサイズバリエーションを増やし、対象細菌の性状に合わせてFemDAのサイズを選択できるようにプロトコールの改善を行った。培養株を用いて、個体群の増殖サイクルにそった、個体性状測定では、1)細菌密度、2)各個体の細胞サイズ、各個体の細胞膜結合型酵素の有無の検証を行った。この検証から同種(同一クローン)内での個体の形質のばらつきを明らかにした。また、隔離した細胞がFemDAの液滴内で複数回分裂する事が確認できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナ禍の影響を受け、下記2点が原因となり研究の進捗が遅れている。１）実験施設/機材の使用が制限された期間があったため。2）使用予定試薬消耗品の手配が困難であったため。一方で、令和3年度に、対象細菌の性状に合わせたFemDAのサイズ選択プロトコールを作成することができたので、次年度実施する実験に関しては効率良く作業を進めることができる目処が立っている。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度も、3年度に予定していた「FemDAを用いて隔離した細菌細胞の性状測定のための、デバイス改良とデータ検証」を引き続き進める。
単離細菌培養株を使用したFemDAの測定検証として、1)各個体の核酸量、2)各個体の特性細胞膜結合型酵素活性、3)細胞外酵素活性に焦点をあて、条件の調整を行う。さらにマイクロマニピュレーターをもちいて単一ドロップレット内の細胞試料および溶液試料の回収を行い、シングルセルでの細胞成分解析、遺伝子解析も同時に推進し、個体性状観察パラメータの重点化を目指す。 観察対象である細菌の培養、環境細菌の採取、観察および生理測定等の微生物学的測定全般は研究代表者の横川が行う。FemDAの作成、液滴サイズの最適化、計測環境の構築、酵素活性測定のためのアッセイ系の構築は研究分担者である張が行う。手法確立に向けた計画・実行・ 評価・改善は研究代表者と分担者が協力して行う。

Causes of Carryover

コロナ禍の影響で実験の進捗が遅れ、それに合わせる形で実験にかかる試薬及び消耗品購入量に変更が生じたため。