Development of fundamental technology for electron microscopic imaging of short-lived chemical species

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K21486
• Research Institution: Gifu Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 平山 祐 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (10600207)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2022-03-31
• Keywords: イメージング / 活性酸素種 / ナノイメージング

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、原理的に不可能とされていた電子顕微鏡での細胞内短寿命活性種のナのイメージングを達成する。申請者がすでに達成している細胞膜として存在する 物質を足場として利用し、プローブを固定する技術、および光増感剤の標的選択的スイッチ技術を融合し、新たな生体内短寿命活性種の電子顕微鏡プローブを創 出する。また、得られたプローブ分子を利用したナノイメージング研究を実施し、標的化学種の局在、動態をナノレベルで明らかにすることを目的とする。 当該年度においては昨年度に引き続き、プローブ分子の細胞内固定法と、超解像蛍光顕微鏡による固定化型スーパーオキシド観察実験を実施した。 細胞内の足場分子として、既報に従って細胞中の脂質膜へとアジド基を導入した。そこへスーパーオキシド検出蛍光プローブを導入し、各種スーパーオキシド誘導物質を投与し、一定時間後に細胞固定、超解像蛍光顕微鏡観察を実施した。刺激物質にてスーパーオキシドを誘導した細胞で有意な蛍光上昇が見られ、その蛍光がミトコンドリアおよび小胞体膜上に局在している様子が見られた。また、いくつかのアジド基への選択的反応基について、修飾効率、局在、細胞 内でのスーパーオキシド反応性を検討したが、大きな差はなく、全て適度に応答することがわかった。以上のことから、本アプローチがナノイメージング観察において有用であることが示された。
本年度はさらに、鉄(II)イオンを標的とした細胞膜固定型蛍光プローブを開発し、同様に細胞での機能評価を実施した。その結果、スーパーオキシドの場合と同様、鉄処理群で有意な傾向上昇が見られた。今後、さらに電子顕微鏡観察に向けた最適化を実施する。