2022 Fiscal Year Annual Research Report
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20K21503
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
島田 緑 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (60444981)
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2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | プロリン異性化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ペプチジルプロリルイソメラーゼ（PPIase）は、タンパク質の高次構造を変化させるためにプロリンの異性化反応を触媒する。PPIaseにはFKBP、シクロフィリン、およびPin1の3つのファミリーが存在するが、この中で研究代表者はFKBPに焦点を当てた。FKBPは16種類存在し、細胞増殖や転写などの重要な生命現象に関与しているが、詳細な機能や役割はあまりわかっていない。その理由は、PPIaseが標的とする基質の同定が困難であることが推測さる。さらにFKBPにはコシャペロンとして働く機能と、プロリン異性化酵素としての機能があるが、酵素活性が生命現象に重要であるかについてはあまり知られていない。
まず研究代表者は異性化候補のペプチドを合成した。PPIaseの活性によってプロリンがトランス体に変化すると、キモトリプシンが選択的にフェニルアラニンを切断し、pNAが溶液中に遊離される。そのpNA由来の吸光度（390 nm）の変化を測定することで、異性化酵素活性を測定できるアッセイ系を構築した。
さらに、同定した基質の異性化部位に対して異性化変異体を作製し、野生型と変異体にFLAGタグを付けて293T細胞で過剰発現させた。そして、FLAG-pull downとプロテオミクス解析により、結合する因子を包括的に特定した。異性化部位変異体と野生型との間で結合が変動する因子が50以上取得され、免疫沈降により結合状態の変化を詳細に検討した。その中で、異性化部位変異体において結合が増加または減少する因子としてDNA修復酵素に着目した。野生型と異性化部位変異体との比較で、DNA修復酵素の結合が異性化部位変異体では大幅に減少することが明らかになった。この結果から、異性化を介したDNA修復の活性調節が行われている可能性が示唆された。
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