Does GPI-anchored modification promote the pathogenicity and transmissibility of alpha-synucleinopathies?

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21579
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 新 竜一郎 宮崎大学, 医学部, 教授 (90452846)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今村 守一 宮崎大学, 医学部, 准教授 (10391442)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: αシヌクレイン / GPIアンカー

Outline of Annual Research Achievements

プリオン病と比較すると、その他の蛋白異常凝集性神経変性疾患（アルツハイマー病、レビー小体病、タウオパチー等）の伝達性や病原性は低く、そのメカニズムに質的な違いがあることが想定されている。その違いをもたらす大きな要因と考えられるものとしてPrPのC末端に翻訳後修飾として付加されるGPIアンカーが考えられる。本研究では蛋白凝集性神経変性疾患の病原タンパク質（αシヌクレイン、タウタンパク質、 TDP-43）にGPIアンカーを付加して発現するように遺伝子操作し、その凝集様式・疾患伝達性と神経変性（神経毒性）のメカニズムを解明することを目的としている。まず、GPIアンカー付加シグナルペプチドをαシヌクレイン（Asyn）のN末とC末に導入し、それぞれのタンパク質へのGPIアンカー修飾型を構築した。GPIアンカー付加シグナルペプチドとしてはプリオンタンパク質（PrP）のものを用いた。構築した発現ベクターを培養細胞（N2a）に一過性に導入し、Asynの発現をウェスタンブロットにより確認した。GPIアンカーが導入されたことを反映し、GPIアンカーのない通常のAsynより分子量は上昇していた。次に、恒常的発現細胞を得るため、トランスポゾンのPiggyBac systemを用いて薬剤セレクションを行い、現在解析を進めている。また、試験管内変換反応において通常のAsynやGPIアンカーを導入したAsynがシード（Asynの凝集体：アミロイドフィブリル）を添加した際に、プロテイナーゼK抵抗性の凝集体が誘導されるかどうか、細胞死が誘導されるかどうかについても検証を開始している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

GPIアンカー修飾型αシヌクレイン（Asyn）発現ベクターを構築し、培養細胞において実際に発現することを確認できた。さらに恒常的発現細胞の作製を開始し、薬剤選択を現在行っているなど、計画初期の進捗を概ね達成していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後、GPIアンカー修飾型αシヌクレイン（Asyn）の恒常的発現細胞を作製し、GPIアンカー修飾のない通常のAsyn発現細胞との局在や代謝の相違についての解析を進める予定である。さらに、Asynの異常凝集体の形成を起こすか、細胞死が誘導されるかどうかについてなどについても検証を行う。

Causes of Carryover

今年度は初年度であり、研究を開始して間もなく、研究計画の進展状況は限られたため、次年度使用額が生じた。