Does GPI-anchored modification promote the pathogenicity and transmissibility of alpha-synucleinopathies?

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21579
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 新 竜一郎 宮崎大学, 医学部, 教授 (90452846)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今村 守一 宮崎大学, 医学部, 准教授 (10391442)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: GPIアンカー / αシヌクレイン / プリオンタンパク質

Outline of Annual Research Achievements

プリオン病以外のタンパク質異常凝集性神経変性疾患（アルツハイマー病、レビー小体病、タウオパチー等）の伝達性や病原性はプリオン病と比較すると相対的に低く、そのメカニズムに質的な違いがあることが想定される。その要因ととしてプリオンタンパク質（PrP）のC末端に翻訳後修飾として付加されるGPIアンカーの存在が挙げられる。本研究ではタンパク質異常凝集性神経変性疾患の病原タンパク質（αシヌクレイン、タウ）にGPIアンカーを付加して発現するように遺伝子操作し、その凝集様式・疾患伝達性と神経変性のメカニズムを解明することを目的としている。まず、GPIアンカー付加シグナルペプチドをαシヌクレイン（Asyn）のN末とC末に導入し、それぞれのタンパク質へのGPIアンカー修飾型を構築した。GPIアンカー付加シグナルペプチドとしてはPrPのものを用いた。構築した発現ベクターを培養細胞（N2a）に一過性に導入し、Asynの発現をウェスタンブロットにより確認した。GPIアンカーが導入されたことを反映し、GPIアンカーのない通常のAsynより分子量は上昇していた。次に、恒常的発現細胞を得るため、トランスポゾンのPiggyBac systemを用いて薬剤セレクションを行ったが、高発現細胞を得ることはできなかった。しかし、遺伝子レベルの導入はPCRで確認していたため、GPI（＋）Asynがプロテアソームでの分解が上昇している可能性を考え、プロテアソーム抑制剤を投与したところ、発現の上昇を認めた。この点を克服する方法として現在、GPIシグナル配列前の、AsynのC末にPｒPの配列を導入した変異体の作製を進めている。また正常マウス由来脳乳剤を用いた試験管内変換反応であるPMCA法において、シード（Asynの凝集体：アミロイドフィブリル）を添加した場合に脳乳剤中のAsynの凝集が誘導されることなどを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GPIアンカー修飾型αシヌクレイン（Asyn）発現ベクターを構築し、恒常的発現細胞の構築を試みたが、多くがプロテアソーム系で分解されてしまうことが判明した。この点を克服する方法としてAsynのアミノ酸配列の後にPrPのC末配列を導入し、プロテアソーム系での分解を減少させることを試みている段階である。

Strategy for Future Research Activity

今後、GPIアンカー修飾型αシヌクレイン（Asyn）/PrP融合タンパク質の恒常的発現細胞を作製し、GPIアンカー修飾のない通常のAsyn発現細胞あるいはPrP発現細胞との局在や代謝の相違についての解析を進める予定である。さらに、それらの細胞を用いてAsynの異常凝集体の形成の有無や、細胞死が誘導されるかどうかについてなどについても検証を行う。

Causes of Carryover

GPIアンカー修飾型αシヌクレイン（Asyn）発現ベクターを構築し、恒常的発現細胞の構築を試みたが、多くがプロテアソーム系で分解されてしまうことが判明したため、新たに実験系を見直し、発現ベクターの作製に時間を要したため。