2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of new therapies using outer membrane vesicles derived from gut microbiota
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20K21603
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
山下 智也 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (90437468)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / 外膜小胞 / リポ多糖 / microRNA / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、腸内細菌の外膜小胞(Outer membrane vesicles; OMVs)を介する生体作用を解明して、疾患治療への応用法を探索し、生体利用(臨床応用)の可能性を検証することである。OMVsは、細菌が分泌する20～250nm程度の大きさの脂質二重膜構造を持つ球状の小胞で、リポ多糖を含む種々の菌体成分や各細菌のタンパクや核酸が含まれる。
特に、我々が研究を進めている動脈硬化を予防する腸内細菌Bacteroides vulgatusとBacteroides doreiのOMVsについて、その(1)構造・内容物と産生機構、(2)生体内動態と生体作用、(3)動脈硬化・動脈瘤の病態への影響 を明らかにすることを目指す。
まずは、様々な実験に使用できるレベルの不純物の少ないOMVsを単離することを目指した。当初は、商業販売されているOMVs抽出キットを使用して単離を試みたが、電子顕微鏡で確認すると思うようには採取できなかった。最終的には菌の培養液から超遠心法によりOMVsを抽出し、電子顕微鏡で確認して単離に成功したことを確認した。この採取方法は、ヒト血液からのエキソソーム抽出法と同じであり、当初の仮説である「菌のOMVsが、ヒトの生体内に移行し、エキソソームのように臓器の遺伝子発現に影響を与える可能性がある」という仮説をサポートするものとなった。OMVsで培養細胞を刺激すると、膜に当該菌由来のリポ多糖LPSを保持しており、炎症活性を示した。そして大腸菌由来LPSに比較して、Bacteroides２菌種LPSは、TLR4を活性化する力価が低いことがわかっているが、大腸菌由来OMVsに比較して、Bacteroides２菌種OMVsでは、免疫刺激作用が弱いことが示された。OMVsが当該菌由来のLPSを保持することは間違いなさそうである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
OMVsの単離に、かなりの時間を要する可能性があったが、初年度内に成功し、電子顕微鏡で確認して実験に使用できるレベルの不純物の少ない安定したOMVsを確保できた。すでに細胞刺激実験も実施しており、計画通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養免疫細胞の刺激実験を行う中で、どのような機序で細胞の機能修飾を行う可能性があるのか？を検証する。またマウス疾患モデル（現状では、動脈硬化マウスモデルを想定）に対して、腹腔内・経口・経肛門的に投与することで、生体にどのように移行し、どのように作用するのかを実験し、病態への影響を検証する。マウスへの投与実験では、特に腸管から血液中への移行があるのかを検証することが最も重要であり、蛍光ラベルしたOMVsをマウスの胃内や大腸内に投与して、臓器移行が認められるかを実験する。
ヒト生体内で、自己の他臓器由来のエキソソームが、含有するmicroRNAの影響により標的臓器の遺伝子発現を変化させ、機能に影響を与えることがしめされ、臓器連関の一つの機序として重要であることがわかっている。これと同じようなことが、腸内細菌由来のOMVsにより宿主の臓器で起きているのではないかという仮説をたて、OMVsに含まれる細菌由来の20数塩基のmiRNA、smallRNAのRNAシーケンスを実施して解析する。ヒトで報告されているmiRNAとの相同性があるのかの検討を行い、既報のmiRNAと相同性のあるものが同定できれば、機能を推測して次の実験に進める。さらに、このOMVsがヒトで血中に移行するかどうかの検証のため、すでに公開されているヒト血中のmiRNAのシーケンスデータの中に、我々が遺伝子解析した菌由来miRNAが含まれているかを検証する。
また、OMVsに含まれるLPSのような蛋白や脂質も、血中に移行すれば直接的に細胞や臓器機能に影響を与えると思われ、動物実験で確かめていきたい。
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| Causes of Carryover |
当初から初年度は半年での研究実施であり、すべて支出予定ではない。比較的順調に研究が進行したのでほぼ全額に近い額で使用している。
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