A study of the role of mitophagy in hearing disorder

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21646
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 山岨 達也 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (60251302)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木下 淳 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (10755648) ; 樫尾 明憲 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (20451809) ; 鴨頭 輝 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (30807152) ; 藤本 千里 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (60581882)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2022-03-31
• Keywords: 蝸牛 / ミトコンドリア / オートファジー / 酸化ストレス / ミトファジー

Outline of Annual Research Achievements

HEI-OC1細胞をPQQ(0.1、1.0nM)に1日間曝露した後、過酸化水素(100μM)を1時間曝露し、ミトコンドリア機能及びSIRT1/PGC-1α経路の機能を評価した。老化モデルでのミトコンドリア呼吸能、ATP産生速度、ミトコンドリア膜電位・融合・運動性の障害はPQQ処理群で保護効果が見られ、SIRT1及びPGC-1αの発現は老化モデルで減少したが、PQQ処理群では有意に上昇し、PGC-1αのアセチル化はPQQ処理群で有意に減少した。この結果はPQQが内耳細胞老化モデルにおいてミトコンドリア保護効果を持ち、SIRT1/PGC-1α経路が関与していることを示唆している。加齢性難聴モデルでは、対照群では通常の水道水、PQQ投与群ではPQQ 24mg/Lを溶解した水道水を用い、2ヶ月齢、6ヶ月齢、8ヶ月齢における聴力をABRにて評価した。組織学的評価は8ヶ月齢のABR評価後に組織を固定し、HE染色、Myo7A、CtBP2、GluR2、NF200による蛍光免疫染色を行い、有毛細胞数・らせん神経節細胞数・血管条の面積・リボンシナプス数の密度・神経線維数の密度をImageJ/FIJIによる画像処理を用いて計数評価した。その結果、PQQ投与群では対照群と比べて8カ月における8および32kHzのABRにおいて約30および20dBの保護効果が見られ、有毛細胞数・らせん神経節細胞数・血管条の面積・リボンシナプス数の密度・神経線維数の密度も有意に高かく、PQQがin vivoでも加齢性難聴に対して保護効果を持つことが示された。二酸化ゲルマニウム摂取マウスでは4ヶ月までに重度難聴を呈し、タウリン＞CoQ10＞水素水の順に障害が抑制されることが、ABRおよび組織学的解析で確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では難聴におけるMitophagyの役割について解析する予定で、加齢性難聴とミトコンドリア障害動物を用い、聴覚機能をABR等で評価し、組織は透明化技術等を用いて網羅的に観察し、細胞内ミトコンドリアの状態と量、Mitophagyの蝸牛内分布などを解析、また蝸牛内のMitophagyやミトコンドリア生合成等に関する遺伝子、ミトコンドリア機能やMitophagy の重要なマーカーの量を難聴出現前後の異なる時期で解析、さらにHEI-OCI細胞に酸化ストレスを与え、ミトコンドリアの変性、細胞生存率、膜電位、ATPの変化等を調べ、同時にタウリン等の予防効果についても調べる予定であった。このうち、障害動物モデルとしてC57BL/6（加齢性難聴）、二酸化ゲルマニウム摂取マウス（ミトコンドリア機能障害）に加えて音響外傷も行うなど、in vivo の解析は順調に進んでおり、PQQにより老化抑制の介入したマウス、タウリンやCoQ10によるゲルマニウムのミトコンドリア障害に対する抑制介入マウスも順調に解析できている。聴覚機能は聴性脳幹反応（ABR）ではできたが、歪誘発耳音響放射（DPOAE）はうまく記録されなかった。組織学的評価では透明化技術の時間がかかるため、切片とsurface preparationでの評価となった。蝸牛内の異なる細胞におけるミトコンドリアの状態と量、Mitophagyの蝸牛内の分布とその強度については、まだ解析が進んでいない。in vitroではHEI-OCI細胞に対するH2O2暴露による老化促進モデルで、ミトコンドリアの変性、細胞生存率、膜電位やATPの変化などは調べられており、PQQの影響も完遂できた。遺伝子解析・Western blottingを今後行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

上述したように、in vivoでも細胞内ミトコンドリアの状態と量、Mitophagyの蝸牛内分布などの解析、蝸牛内のMitophagyやミトコンドリア生合成等に関する遺伝子、ミトコンドリア機能やMitophagy の重要なマーカーの量の難聴出現前後での解析を行う。障害動物モデルについては二酸化ゲルマニウム投与モデル、音響外傷モデルの解析を完遂する。in vitroではHEI-OCI細胞に対するH2O2暴露による老化促進モデルで、遺伝子解析・Western blottingを行うなど、mitophagyの本態に迫る予定である。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染のため、2020年4月からの動物の新規購入や試薬の購入などが制限された。このため、7月頃までは実験が進められなかった結果、2021年度に繰り越して一部の実験を行うこととしている。2021年度にwestern blottingやPCRなどの分子生物学的評価を残しているが、比較的経費のかかる研究であり、その解析費用に使用する。