Development of a new method for dental caries prevention by bacteriophage

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K21680
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 小松澤 均 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (90253088)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松尾 美樹 広島大学, 医系科学研究科(歯), 准教授 (20527048) ; 柴 秀樹 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (60260668) ; 岩野 英知 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (60382488) ; 比地岡 浩志 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (70305150)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2022-03-31
• Keywords: バクテリオファージ / ミュータンスレンサ球菌 / う蝕 / 抗菌作用

Outline of Annual Research Achievements

2020年度に同定したバクテリオファージの解析を中心に行った。
１）バクテリオファージの精製およびS.mutansへの効果の検討：精製バクテリオファージを用いてS.mutans臨床分離株123株に対して感受性試験を行ったところ、120株で感受性を認めた。他の口腔レンサ球菌（S. salivarius, S. mitis等）を用いて検証したが、感受性は認められなかった。次に細菌用培地に少量のS.mutans菌株を接種し、同時にバクテリオファージを添加したところ、添加するバクテリオファージ依存的に増殖の抑制効果が認められた。さらにS.mutansを用いたスクロース存在下でのバイオフィルム形成実験においても、S.mutansを培地に接種時にバクテリオファージを添加することで、バクテリオファージ添加濃度依存的にバイオフィルム形成を抑制した。
２）種々の細菌種との共培養試験におけるバクテリオファージの効果の検証：第一段階として、S.mutansと他の口腔レンサ球菌を同じ菌量を接種した後、バクテリオファージ添加し8時間培養後、菌体を回収した。得られた菌体からDNAを抽出し、菌種特異的プライマーを用いて定量性PCRを行い、各菌数を算出し、ファージ非添加の培養後の菌数と比較した。その結果、ファージを添加することでS. mutansのみが特異的に大幅な菌数の減少が認められた、第2段階として、S.mutansと3菌種の共培養試験を行ったところ、同様にS. mutansのみ菌数の大幅な減少が認められた。
３）endolysinの組換えタンパクの作製および溶菌活性の検証：バクテリオファージ上にコードされるエンドライシン様酵素2種について、His-tag融合組換えタンパクを作製し、精製を行った。精製過程でタンパクが不溶性となるため、薄い濃度で溶菌活性を検証したが、効果は認められなかった。