光誘導RNA導入法を応用した骨再生のための新規ドラッグデリバリーシステムの開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21895
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 江國 大輔 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (70346443)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 学 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (40157904) ; 福原 瑶子 (内田瑶子) 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (60779742) ; 片岡 広太 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (80744185)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 歯周病 / マイクロRNA / 骨再生

Outline of Annual Research Achievements

歯周病の中でも、歯を支える骨（歯槽骨）までもが吸収する「歯周炎」に進行すると、食べ物がうまく噛めないなどの機能障害、さらには生活の質の低下やフレイル（虚弱）を引き起こす。よって、歯槽骨の吸収を制御することは歯周病の予防および治療にとって非常に重要である。
近年注目されているマイクロRNAは、全ての生命現象に関わる遺伝情報を制御する。そこで、将来の歯周病治療への応用を目指すために、本研究の目的は、実験光増感剤を付加した光応答性マイクロRNAキャリア蛋白質を使用して、細胞内にマイクロRNAを導入して、培養細胞に対する影響を調べることとした。
当該年度は、キャリアの作製方法および導入方法の確認を行った。既存の方法に沿って、その再現性を確認した。Alexa Fluor 546 fluorophore（TatU1A）というキャリアタンパク質を作製した。このタンパク質は細胞内侵入能を持ち、shRNAのU1A配列 (ループ部分) を認識しshRNAと結合することができる。まず、プラスミドを導入して大腸菌の形質転換を行った。次に、形質転換した大腸菌を培養し、増殖させて、TatU1A-Cを作った。大腸菌を破砕し、TatU1A-Cをカラムで精製した。精製したTatU1Aに光増感剤であるAlexa546を修飾し、ゲル濾過で精製した。光増感剤は光増感反応によりエンドソーム膜を破壊することができる。そして、光増感剤修飾TatU1AにshRNAを結合させた。この複合体を細胞のエンドソーム内に取り込ませた後に光照射し、細胞質内へ移行したことを顕微鏡下で観察した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルスの影響で、必要物品の納入などに遅れが出たため。

Strategy for Future Research Activity

まずは、骨芽細胞を用いて、試薬によるトランスフェクション法およびエレクトロポレーション法をポジティブコントロールとして確認する。視覚的な細胞内移行と、増骨活性に関与するシグナルの変化をそれぞれ確認する。
次に、実験光増感剤を付加した光応答性マイクロRNAキャリア蛋白質を使用する。作製したキャリアの細胞内移行と、視覚的な細胞内移行と、増骨活性に関与するシグナルの変化をそれぞれ確認する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響などにより、研究に遅れが生じており、マイクロRNAの購入や関連試薬などを購入をしなかったため。
マイクロRNAや関連試薬などを当初の予定通り購入予定としている。