Controlling bi-directional Notch-Delta signalling in hippocampal neural stem cells to enhance the self-renewal and the neurogenesis

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21913
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 大久保 佑亮 国立医薬品食品衛生研究所, 毒性部, 主任研究官 (80596247)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2022-03-31
• Keywords: Delta-Notchシグナル / 神経新生 / AAV / Multivalent ligands

Outline of Annual Research Achievements

記憶障害やうつ病などの社会的に治療要請が高い疾患と海馬神経新生低下との関連が指摘されており、治療を目指し様々な神経新生賦活化法が研究されている。しかし、単に神経新生を促進するだけでは後に神経幹細胞数や神経新生能の減少を伴うことが報告されており、副作用が懸念される。そのため、まず神経幹細胞の自己複製を、次に神経新生を賦活化する2段階の手法を開発する必要がある。Notchシグナルは神経幹細胞の自己複製を促進することが知られるが、一方で申請者はNotchとは逆方向のDeltaシグナルが神経幹細胞の神経分化を促進することを発見した。本研究では、共同研究者であるカリフォルニア大学バークレー校のDavid Schaffer教授と開発してきた1) シグナル伝達能を飛躍的に高めるタンパク質のクラスター化技術と2) 神経幹細胞（NSC）特異的な感染能を上昇させたる変異型アデノ随伴ウイルスAAV r3.45を用い、2段階の神経新生賦活化法を開発する。これまでに我々は、培養系においてクラスター化Dll1がラット神経前駆細胞 rNPCs)のNotchシグナルを活性化させ下流のHes1遺伝子発現を上昇させる結果や、Dll1細胞内ドメイン(D1ICD)がrNPCsの神経新生を促進することを明らかにした。そこで、ステレオタキシック装置を用い、ラット海馬にクラスター化Dll1を投与しNotch1を発現するNSC特異的にNotchシグナルを活性化させ自己複製を促す。
本年度は、ステレオタキシック装置を用いたラット海馬へのインジェクション法を取得した。次に293T細胞を用いてCMVのミニマムプロモーター下でGFPを発現するAAVr3.45を作製した。ステレオタキシック装置を用い、6週齢のF344メスラットの海馬にAAVr3.45をインジェクションし、海馬においてGFPの発現を免疫組織化学法により確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究に必要な実験手技を取得したことで、研究が円滑に進むと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

まず、ラット海馬にクラスター化Dll1をインジェクションし、Notchシグナルの活性化によるNSC自己複製賦活化作用を検討する。次に、AAVr3.45を用い、DeltaシグナルをNSC特異的な活性化することで神経新生賦活化を試みる。最後に上述の実験を組み合わせ、Notch-Deltaシグナルを双方向に活性化し、NSCの自己複製及び神経新生の賦活化を試みる。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響により、予定していた学会発表を取りやめたことによる旅費分差額が生じた。加えて、同様の理由で購入予定であった消耗品の中で手に入らないものがあり購入を見送った。
生じた差額は、見送った消耗品の購入に充てると共に、より詳細な解析をするために、抗体などの試薬の購入に活用する。