Reconstruction of mycoplasma gliding motility in synthetic bacterium by using whole genome cloning method

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K22643
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 水谷 雅希 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 産総研特別研究員 (60886274)
• Project Period (FY): 2020-09-11 – 2022-03-31
• Keywords: マイコプラズマ / ゲノムクローニング / 合成細菌

Outline of Annual Research Achievements

淡水魚の病原性細菌であるMycoplasma mobileは、寄生に特化するために進化の過程において宿主免疫に認識されやすいペプチドグリカン細胞壁とべん毛を失ったことで、新奇な滑走運動を獲得した。この極めてユニークな滑走運動マシナリーの全容解明には、標的遺伝子の欠損株作製が必須であるが、Mycoplasma mobileでは遺伝子ノックアウトが不可能なため、欠損株を用いた解析が非常に困難という大きな問題を抱えている。この問題を解決する新たなアプローチとして、本研究では、Mycoplasma mobileの全ゲノムを酵母内にクローニングし、それをマイコプラズマを基に創られた合成細菌に導入することで、滑走運動を合成細菌で再現し、また、酵母の遺伝子操作技術をクローニングゲノムに用いることで、滑走運動の変異株作製とその機能解析から滑走運動マシナリーの解明を目指す。
初年度である本年度は、主に酵母でのゲノムクローニングを行った。培養したMycoplasma mobile菌体をアガロースプラグに封入し、タンパク質分解酵素と界面活性剤処理によってゲノムDNAを露出させた後、制限酵素処理を行った。次にこのゲノムDNAを合成細菌への導入を可能にするvectorと共にスフェロプラスト化した出芽酵母に導入し、transformation associated recombination (TAR)法を用いて、酵母内にyeast artificial chromosome (YAC)として クローニングした。この形質転換体酵母をマルチプレックスPCRと次世代シーケンサーによって解析し、Mycoplasma mobile全ゲノムがクローニングされていることを確認した。また、合成細菌へのゲノム移植についても取り組み始めており、ゲノムの一部を導入することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゲノムクローニングを完了し、ゲノム移植のフェーズに移ることができた。

Strategy for Future Research Activity

今後はゲノム移植をメインに行っていく。ゲノムの一部の導入には成功したものの、全長の導入にはまだ至っていない。合成細菌の種類の選定、レシピエント細胞の培養状態の検討、導入ゲノムの精製度の検討が課題であると考えている。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は、コロナウイルス蔓延により学会等の中止や、オンライン化により旅費がかからなくなったこと、また参加費の減額があったため。
次年度の消耗品費として使用する計画である。