2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of a fluorescent GABA probe for analysis of pathological mechanism in autism spectrum disorder
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20K22699
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
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Principal Investigator |
瀧川 健司 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 主任研究員 (60749274)
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| Project Period (FY) |
2020-09-11 – 2023-03-31
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| Keywords | GABA / 蛍光プローブ / 自閉症スペクトラム障害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度では、自閉症病態における抑制性シナプス前部の分子の発現量をSTED（Stimulated Emission Depletion）顕微鏡を用いてシナプス単位で定量解析するために、野生型マウス由来の凍結脳切片を用いて、抗体、蛍光色素および封入剤の選定、免疫染色条件およびSTED顕微鏡の光学設定条件の最適化を行った。その結果、解析対象分子はおおよそ100～200 nmのパンクタ状に観察され、非常に強力なSTED光の照射下においてもほとんど光退色することなく、解析対象分子に特異的な蛍光シグナルを得られるようになった。解析対象分子として、シナプス前部に局在してシナプス小胞の開口放出機能に関連する4分子（Bassoon、Piccolo、Munc13、電位依存性カルシウムチャネル）を選定した。続いて、抑制性シナプス前部に局在する解析対象分子のみの定量解析を可能にするために、抑制性シナプス前部と後部のマーカータンパク質（VGAT、Gephyrin）を合わせて免疫染色した三重免疫組織化学染色に最適な一次抗体および二次抗体の組み合わせを探索した。その結果、一部の解析対象分子が抑制性シナプス前部と後部のマーカータンパク質と共局在した様子を捉えることに成功し、抑制性シナプス前部に局在する解析対象分子のみの定量解析を可能にした。さらに、自閉症病態におけるシナプス前部の分子の発現異常が抑制性シナプスに限定的であるのか、あるいは興奮性シナプスにおいても同様に発現異常が認められるのかを明らかにするために、解析対象分子と興奮性シナプス前部と後部のマーカータンパク質（VGLUT1、PSD-95）との三重免疫組織化学染色についても行えるようにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していたシナプス前部の分子をシナプス単位で可視化する超解像イメージング技術の確立を順調に進めることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
自閉症病態において抑制性シナプス前部のGABA放出機能にどのような変化が生じているのかを調べるために、昨年度に開発したGABA蛍光プローブを用いて神経細胞のシナプス前部から開口放出されるGABAを計測するGABA蛍光イメージング技術を確立する。また、GABA蛍光イメージング技術と超解像イメージング技術を組み合わせて、自閉症病態において抑制性シナプス前部の機能や分子の発現パターンにどのような変化が生じているのかを調べる。
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| Causes of Carryover |
超解像イメージング技術を確立するために購入を予定していた一部の消耗品については、評価の実施を予定していた全ての抗体や蛍光色素を試す前に、実験に耐え得る性能を有した抗体と蛍光色素の選定が完了し、購入を見送ったため。次年度に繰り越した額は、データ解析を効率化するために、解析ソフトウェアやハードウェアなどの購入に使用する計画である。
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Research Products
(5 results)
