2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of a fluorescent GABA probe for analysis of pathological mechanism in autism spectrum disorder
| Project/Area Number |
20K22699
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
|---|
Principal Investigator |
瀧川 健司 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 主任研究員 (60749274)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-09-11 – 2024-03-31
|
| Keywords | GABA / 蛍光プローブ / 自閉症スペクトラム障害 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、自閉症病態において抑制性シナプス前部のGABA放出機能にどのような変化が生じているのかを調べるために、神経細胞のシナプス前部から開口放出されるGABAを計測するGABA蛍光イメージング技術の確立を目指している。本年度は、本研究課題で開発したGABA蛍光プローブを細胞膜上にストレプトアビジン-ビオチンを介して固定することで、培養神経細胞や脳スライス標本において抑制性シナプスから細胞外に放出されるGABAを定量的に計測する手法の構築を試みた。この手法では、GABA蛍光プローブをビオチン化し、ストレプトアビジンと混合することでストレプトアビジンとGABA蛍光プローブの複合体を形成させ、ビオチン化した神経組織に複合体を添加することでGABA蛍光プローブを細胞膜上に固定する。ストレプトアビジン1分子あたりのGABA蛍光プローブの分子数を最大にし、GABA蛍光プローブを効率よく細胞膜上に固定するために、ストレプトアビジンとGABA蛍光プローブの混合比の異なる複数種類の複合体を、ビオチン化した非神経細胞の標本に個別に添加後、各細胞標本を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光画像の輝度値を比較した。その結果、細胞膜を最も明るく染色できる混合比を決定することができた。さらに、細胞膜上に固定したGABA蛍光プローブの性能を評価するために、GABA蛍光プローブを固定した細胞標本にGABAの終濃度が1 mM以上となるように高濃度のGABAを添加した。その結果、GABAの添加前後で蛍光強度が増加した。これらの結果から、GABA蛍光プローブは、細胞膜上に固定された環境下においてもGABAに対する応答性が維持されていることが明らかとなった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していたGABA蛍光イメージング技術の確立を順調に進めることができたため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度に構築したGABA蛍光プローブの細胞膜上への固定技術を培養神経細胞に適用し、抑制性シナプスから細胞外に放出されるGABAを観測する蛍光イメージングを試みる。また、GABA蛍光イメージング技術と超解像イメージング技術を組み合わせて、自閉症病態において抑制性シナプス前部の機能や分子の発現パターンにどのような変化が生じているのかを調べる。
|
| Causes of Carryover |
初代培養神経細胞の調製・維持のために購入を予定していた消耗品や実験動物の一部については、初代培養神経細胞を使用する予定であった実験が細胞株を代替して完了し、購入を見送ったため。次年度に繰り越した額は、次年度に実施する初代培養神経細胞を用いた実験に必要な消耗品などの購入に使用する計画である。
|
Research Products
(2 results)
