赤痢アメーバの病原性理解・治療標的開発を目指したPI4K複合体の機能解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K22758
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 渡邊 菜月 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任研究員 (00883323)
• Project Period (FY): 2020-09-11 – 2022-03-31
• Keywords: phosphatidylinositol / PI4K / PI4P / TTC7

Outline of Annual Research Achievements

Phosphatidyl inositol 4-kinase (PI4K) の補助因子の機能解析のために、補助因子であることが予想された結合分子である赤痢アメーバ(Eh)TTC7とEHI_151680についてGFPタグ融合タンパク質発現赤痢アメーバ株を樹立し、免疫蛍光染色により局在解析を行った。その結果、局在は細胞質であり、PI4KやPI4Pとは異なる局在であった。さらに、EhTTC7、EHI_151680の遺伝子発現抑制株を樹立した。これらの株について、運動能力の低下が見られないことが確認された。また、PI4Kの活性を測定するために、PI4Kのリコンビナントタンパク質の発現実験を行っているが、全長が5 kbpと長いため、さらなる条件検討等を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

PI4K の補助因子であるEhTTC7、EHI_151680の発現株について、現在までに試したタグとの組み合わせでは、局在解析に十分な発現量を得ることができなかったため、局在が不明のままである。また、補助因子の遺伝子発現抑制株では、表現型をみつけることができず、現在も探索中である。PI4Kは全長が5 kbpと長いため、リコンビナントタンパク質の発現がうまくいかず、活性測定を行うことができていない。

Strategy for Future Research Activity

PI4Kの補助因子EhTTC7、EHI_151680の発現株については、タグの組み合わせを変えること、また薬剤選択時の薬剤濃度を上げ、タグ付加タンパク質の発現量の増加を試みる。発現量の増加が確認された後、局在解析や免疫沈降実験を行いそれぞれのタンパク質の機能解析を行う。またこれらの遺伝子発現抑制株については、現在までに観察・測定できていない表現型があるため、これらの実験を行い、遺伝子発現抑制による影響を明らかにする。PI4K リコンビナントタンパク質については、上清分画にタンパク質発現量を増やすための条件検討を続ける。また、全長が5 kbpと長いことが問題であるとも考えられるため、kinase domainのみのリコンビナントタンパク質を発現し活性測定を行うことも考える。

Causes of Carryover

昨年度、開催予定だった学会がCOVID-19の影響により中止やオンライン開催となり、旅費としていた予算を使わなかったため。また、先述した問題点があるため、まだ必要な解析を行うことができていない実験が多い。次年度、適切な条件検討の後に実験を進め、さらなる解析等を行う際に予算を使用する予定である。