自然免疫シグナルから迫る造血器腫瘍の分子病態

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K22933
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 武藤 朋也 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90723560)
• Project Period (FY): 2020-09-11 – 2022-03-31
• Keywords: 自然免疫シグナル / 造血器腫瘍 / ユビキチン / ミトコンドリア

Outline of Annual Research Achievements

加齢は造血幹細胞において体細胞変異を蓄積させクローン性造血を引き起こす。特に血液学的異常を伴わないクローン性造血はCHIPと称されている。CHIP関連遺伝子変異体は造血器腫瘍への形質転換のリスクが高い事が明らかになっているものの、その機序の詳細な理解には未だ至っていない。申請者は、先行研究の結果とは相反する知見として、自然免疫シグナル低下がCHIP関連遺伝子変異体の造血器腫瘍への形質転換と関与していることを見出した。この知見と符合するように、自然免疫シグナルをFLT3-ITDのMPNモデルマウスにおいて増強させると、MPNの表現型を減弱させることも確認した。この現象のメカニズム解明のため、自然免疫シグナル経路において中心的役割をはたしているE3ユビキチンリガーゼTRAF6の新規標的タンパクを同定することを目指し、ユビキチン化ペプチド（K-ε-GGを含むペプチド）に対する抗体と質量分析器を用いて、E3リガーゼTARF6の白血病細胞における基質をリストアップした。この結果から、TRAF6とミトコンドリア機能との関与が示唆されたので、TRAF6KD白血病細胞株におけるミトコンドリア機能を評価したところ、予想どおりミトコンドリア膜電位とTRAF6発現量に関連が確認できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

TRAF6KD白血病細胞株において、ユビキチン化ペプチド（K-ε-GGを含むペプチド）に対する抗体と質量分析器を用いて、E3リガーゼTARF6の白血病細胞における基質をリストアップした。興味深い事に、ミトコンドリア機能に関するタンパクAが基質候補として考えられ、実際TARF6とミトコンドリア機能異常の関連を支持するin vitroのデータも得た。しかしながら、293T細胞を用いて、タンパクAがTRAF6の基質であることの検証実験を行ったが、仮説を証明することはできなかった。ユビキチン化ペプチドのイオン化効率の問題や、TRAF6と間接的な他のE3との関与などが、今回の結果の原因として考えられた。このような状況のため、研究は当初の計画よりやや遅れて進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、これまでとは別の手法を用いてTRAF6の白血病細胞における真の基質を同定することを目指す。方法としては、TR-TUBE法という手法を用いる予定である。TR-TUBE はユビキチンに結合し、脱ユビキチン化酵素やプロテアソームから基質についたユビキチン鎖を保護するため、ユビキチン鎖が結合したままの基質を優先的に細胞内に保つことができる。これとK-ε-GGに対する抗体と質量分析を組み合わせることで、基質の同定を試みる。また、細胞内小器官や核内における基質の同定も計画しており、これら分画の抽出、あるいは核内移行シグナル、ミトコンドリア移行シグナルなどを導入したTRAF6変異体を用いることで、より高精度な基質の同定を目指す。

Causes of Carryover

実験を進める中で当初の仮説と異なる結果を得た。そのため、予定していた実験の延期・中止を余儀なくされたため。