免疫受容活性化チロシンモチーフを有する新規分子の骨代謝と矯正学的歯の移動への作用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K23069
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 小川 紗衣香 東北大学, 大学病院, 医員 (60882397)
• Project Period (FY): 2020-09-11 – 2022-03-31
• Keywords: 破骨細胞

Outline of Annual Research Achievements

破骨細胞の分化において、NFATc1（破骨細胞形成マスター転写因子）の活性化に必要なカルシウムシグナルの誘導はITAMを有するアダプター分子を介する。ITAMをもつアダプター分子FcRγやDAP12の遺伝子二重欠損マウスは破骨細胞の分化障害を示すことから、ITAMが破骨細胞の分化に必須であることが報告された。一方、細胞増殖のシグナル伝達に関わる機能分子としてITAMを有するSTAMが同定されている。現在までに野生型マウスから作成した破骨細胞前駆細胞にレトロウィルスベクターを使用してSTAM1分子を過剰発現して破骨細胞形成を行ったところ、過剰発現したほうが破骨細胞形成が促進された。一方、破骨細胞前駆細胞にshRNAを使用してSTAM1をノックダウンして破骨細胞形成を行ったところ破骨細胞形成は抑制された。次に、STAM2をレトロウィルスベクター(pMX-puro)を使用しての破骨細胞前駆細胞への遺伝子導入を試みた。まず、レトロウィルスベクター使用のためレトロウィルスパケージング細胞であるPlat-E細胞のストックを作成した。次に、STAM2のレトロウィルスベクター作成するため、つなぎ変えのベクター作成した。そのベクターよりSTAM2遺伝子を切り出し、pMX-puroにSTAM2遺伝子をつなぎ替えたところまで終了した。その後、Plat-E細胞にSTAM2を組み込んだレトロウィルスベクターをtransfectionする。その後、Plat-E細胞から産生されるレトロウィルスを集める。マウスの骨髄細胞からM-CSFの作用により破骨細胞前駆細胞を作成し、この破骨細胞前駆細胞に産生されたレトロウィルスを感染させ、細胞DNA内にSTAM2遺伝子を組み込む。この際、M-CSFが大量に必要であるが、そのM-CSFを大量にCMG細胞より作成した。さらに破骨細胞前駆細胞にSTAM1およびSTAM２が発現していることを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在、STAM2のレトロウィルスベクター作成するため、つなぎ変えのベクター作成を試みている。しかしながら、ベクター作成が進んでいない。また、STAM1およびSTAM2遺伝子欠損マウスの入手が終わっていないためSTAM1およびSTAM2遺伝子欠損マウスの骨表現系の形態学的および組織学的解析が進んでない。

Strategy for Future Research Activity

現在、STAM2のレトロウィルスベクター作成するため、つなぎ変えのベクター作成を完了し、今後、Plat-E細胞にSTAM2を組み込んだレトロウィルスベクターをtransfectionし、解析を行う。また、STAM1遺伝子欠損マウスおよび STAM2遺伝子欠損マウスを入手し、それぞれから骨髄細胞を採取し、破骨細胞前駆細胞を作製し、その細胞をM-CSFおよびRANKL存在下で培養し破骨細胞形成を行いin vitroで観察し、コントロールと比較する。大腿骨の組織切片を作成し、骨形態計測を行い比較する。また、大腿骨のμCT撮影を行い、骨の断層画像から、骨梁の三次元的構造を解析し、Tb.Th：骨梁幅、Tb.Sp：骨梁間距離、Tb.Spac：骨梁中心間距離などの骨梁構造を解析し比較する。組織切片のTRAP染色を行い、破骨細胞の数を測定する。

Causes of Carryover

入手予定だったのマウスが、手に入らないため、組織学的解析等を行っていないため、予定どおり進んでいないため、次年度に繰り越し次年度使用額が生じてしまいました。購入は予定通りに行い使用する計画です。