2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of selective and sensitive multi-analyte detection technology for diagnosis of mosquito-borne viral diseases
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20KK0115
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
朴 龍洙 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (90238246)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 竜也 静岡大学, 農学部, 教授 (00397366)
宮崎 剛亜 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 助教 (30775721)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2023-03-31
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| Keywords | 蚊媒介性疾患原因ウイルス / インピーサンス / ウイルス検出 / デングウイルス / ディスポーザブル電極 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度の研究で得られた成果を土台に、ディスポーザブル電極の作製を行った。
1）電極用ナノ複合体の作製： AuNPを包埋したPAni（AuNP-PAni）は、従来界面重合法で合成した結果、直径60 nmの金ナノ粒子が1平方μm当たり9個分布した。しかし、金ナノ粒子の不均一さは凝集しやすく電極素材としては不向きであった。この点を改善するため、金イオン溶液をアニリン溶液に100μｌずつ滴下した反応を行った結果、直径21 nmの金ナノ粒子が1平方μm当たり24個分布し、均一な金ナノ粒子が従来の方法より均一に分布した。インフルエンザウイルスの検出に用いたところ、変動係数20％を11％まで改善することができた。N,S-GQD合成は、クエン酸とチオ尿素溶液を130から190℃、pH４から12の条件で4時間反応を行った結果、pH４と190℃の条件でSの濃度3.7 ppmであった。
2）ストレプトアビジン（Strep）修飾電極の作製及びウイルス検出：計画中のN,S-GQD-AuNP-PAniを基盤とした電極は、N,S-GQDのSの結合状態が不安定で、変動係数が大きくディスポーザブル電極の作製には困難であった。この点を改善するために、AuNP-PAniにStrepを修飾し、ビオチン化したノロウイルス（NoV）抗体を修飾した金電極を開発した。モデルとしてノロウイルス様粒子（NoV-LP）を検出した結果、変動係数10％以下で、検出感度60 ag/mlを得た。この電極を用いて陰性サンプル10個と陽性サンプル10個を検出したところ、陰性と陽性判別が可能であった。この結果をディスポーザブル電極に応用し、チクンクニアウイルス（CHIKV）の検出に用いたところ、変動係数9.7―26.6％、検出感度24 fg/mLを得た。この感度は、オンサイトでの検出に十分な感度であると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
コロナ禍により、海外研究者との研究交流が不可能であったので、市販の生物材料（抗原と抗体）を研究に用いた。しかし、蚊媒介性ウイルスは市販されていないものがが多く、国際共同研究としては遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の研究で得られた成果を土台に、電気的なシグナルを捉え、ウイルスの検出を行うディスポーザブル電極を作製し、海外の蚊媒介性ウイルス、特にデングウイルスの検出を現地で実施する。
1）変動係数が少ない安定した電極の開発： 窒素（N）と硫黄（S）をドープしたグラフェン量子ドット（N,S-GQD）合成の最適化結果を基に、ディスポ電極作製する。しかし、バラツキが多く、変動係数が10％以上である場合、前年度進めたStrep電極をディスポ化する。ディスポ化電極の場合、小型の測定装置が必要であるが、研究室の現有のポテンシオスタットを用いる予定である。この場合、インピーダンスとしての出力が困難な場合、電流をシグナルとして検出しウイルスを検出する。
2）海外での標的ウイルスの検出： 海外共同研究者が収集したデングウイルスやチクングニアウイルスを標的とした電極を作製し、現地の不活化したウイルスを検出対象とする。現地のウイルスについては、ウイルス濃度が既知の場合、検出結果を予め作製済みの検量線により濃度を算出しPCR結果と比較するが、濃度が不明な検体については、陰性・陽性判別のみ行う。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍で国外出張が認められず、海外渡航費の執行が不可能であった。今年度国際共同研究のため現地に赴く予定である。
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