2020 Fiscal Year Research-status Report
International research project on nucleic acid aptamers and their exosome-based application to therapeutics for synucleinopathy
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20KK0126
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
村上 一馬 京都大学, 農学研究科, 准教授 (80571281)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
泉尾 直孝 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50722261)
水口 賢司 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (50450896)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2023-03-31
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| Keywords | アプタマー / エクソソーム / 神経変性疾患 / 計算科学 / 核酸医薬 / ドラッグデリバリーシステム / αシヌクレイン / 国際共同研究 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNAアプタマーは，標的分子に対する高い結合能と選択性を特徴とする．凝集性タンパク質であるαシヌクレイン（αSyn）は，神経変性疾患であるパーキンソン病（PD）の原因物質の一つである．カチオン性の繰返し配列が集中するαSynのN末領域は，凝集に重要な役割を果たすが，抗体では認識されにくいという課題があった．そこで，負電荷が多いRNAアプタマーは，本課題の打開策になりうると考え，本研究では，独自のRNA選抜法とin silico解析法を駆使して，αSynのN末領域特異的なRNAアプタマーを作製し，エクソソームエンジニアリングによってRNAアプタマーによるPD治療法の確立に向けた創薬基盤を築くことを目的としている．
今年度は，繰り返し配列への結合を企図し，αSynのN末端が保持された修飾ペプチドを複数調製した後，RNAアプタマーの選抜をSELEX法にて行った．その結果，一部のフラクションに結合RNAの濃縮が認められた．同時に，RNAとαSynの相互作用をin silico解析するための予備実験として，他のターゲットに対して行われたSELEXで得たRNAプールを用いて，Direct Coupling Analysis解析を行った．またCOVID-19の拡大防止措置によって海外渡航が制限されていることから，次年度以降に実施する予定であった人工エクソソームの作製を前倒しで開始した．さらに，血液脳関門への透過性を高めるタンパク質の過剰発現ベクターの作製にも成功した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度はαSynのN末端が保持されたフラグメントペプチドの調製に取り掛かり，複数の候補ペプチドをそれぞれ得た．49塩基のランダム配列を含む鋳型DNAを基にして，in vitro大量転写によってRNAプールを得た．本プールとαSynを反応させ，SELEX法によって結合RNAの選抜を行った．その結果，一部のフラクションに結合RNAの濃縮が認められた．SELEXを推進する際にしばしば問題になるのは，どこまでSELEXを繰り返す必要があるかである．この点を解決するために，結合能シミュレーターによって結合RNAの存在率を予測することができた．本方法は，今後SELEX選抜を進める上で有用である．同時に，RNAとαSynの相互作用解析に向けて，他のターゲットに対して行われたSELEXで得たRNAプールを用いて，Direct Coupling Analysisの予備的な検討を行った．その結果，十分な濃縮が認められない系においては，本方法の適用が難しいことが明らかとなったため，ドッキングなど他の方法の検討が必要である．
一方，COVID-19の拡大防止措置によって海外渡航が制限されているため，対面の国際交流は困難な状況であるが，オンライン会議ツールを駆使して，国際共同研究の遂行に支障が出ないよう工夫しながら推進している．今年度は，国内でも実施できる実験計画を前倒して行うべく，当初次年度以降に実施する予定であった人工エクソソームの作製に着手した．ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yに対するエクストルージョン法で人工エクソソームを単離し，光散乱法でナノ粒子径測定を行うことにより約150 nmの人工エクソソームを得ることができた．さらに，血液脳関門への透過性を高めるタンパク質を安定発現したSH-SY5Yの調製を目的として，過剰発現ベクターの作製を完了し，想定以上の成果を得た．以上より，当初の計画以上に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
結合RNAの濃縮プールについて次世代シーケンサーを用いて全配列を読み取り，高い結合活性を示したクローン配列について，Direct Coupling Analysisの改良法などによってRNA構造と複合体のモデリングを行う．得られた情報から，RNAの短鎖化と分解耐性の向上を目的として，塩基配列を最適化する．次に，海外への渡航状況を判断しながら，UCLAを訪問し，αSynの凝集形成能を抑制するアプタマーをPICUP法でスクリーニングする．またαSyn凝集体の細胞間における伝播能をヒト胚性腎細胞HEK293Tを用いたFRET法で調べる．渡航が難しい場合，アプタマーをUCLAのBitan研究室に送付し，研究協力者のBitan教授に調べていただく．
続いてLa Trobe Universityを訪問し，モデルマウス脳を用いて，RNAアプタマーで免疫電子顕微鏡解析（あるいは免疫組織染色）を行い，N末が保存されたαSynの蓄積の局在性変化を調べる．同様に渡航が難しい場合，アプタマーをLa Trobe UniversityのHill研究室に送付し，研究協力者のHill教授に調べていただく．
一方，前年度に作製した人工エクソソームについては，サイズだけでなく表面電荷についても電気泳動光散乱法によって測定する．これらのパラメータが人工エクソソームの神経細胞内への取り込みに与える影響について評価するとともに，血液脳関門のin vitroモデルを作製し，人工エクソソームの透過性を調査する．In vivo試験では，蛍光標識した人工エクソソームを作成した後，静脈内投与し，イメージング装置を用いて経時的にその脳内取り込みを追跡できるものと期待される．
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| Causes of Carryover |
研究成果としては，「当初の計画以上に進展している」と判断できるものであったが，新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の拡大防止措置のため，海外渡航が制限された影響は，国際共同研究の交流の点において少なからず支障が生じていることは否定できない．特に，旅費の支出が思い通りに進まなかった．次年度も現地訪問を伴う，対面の研究交流は困難な状況が続くかもしれないが，代替案として，オンライン会議ツール等を駆使して，国際シンポジウム，国際セミナー，相互技術指導などを企画し，本研究の趣旨ならびに目的を達成すべく，これらの運営費用に充てることを計画している．
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Research Products
(4 results)
