2020 Fiscal Year Research-status Report
Study on the molecular mechanism of Ca signaling mediated by plant K channels
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20KK0127
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
魚住 信之 東北大学, 工学研究科, 教授 (40223515)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石丸 泰寛 東北大学, 工学研究科, 准教授 (80590207)
辻井 雅 東北大学, 工学研究科, 助教 (30865887)
齋藤 俊也 東北大学, 工学研究科, 学術研究員 (00825226)
Ellen 東北大学, 工学研究科, JSPS特別研究員(PD) (40870176)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2024-03-31
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| Keywords | イオン輸送体 / Ca / 植物 / シロイヌナズナ / バイオスティミュラント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シロイヌナズナの気孔に発現するCaセンサータンパク質（cameleon）を用いて，イオン輸送体制御化合物と期待されるフラボノイド系化合物を添加して，一過的なCa濃度の上昇をモニターした．本測定は Costa教授の研究室で行う予定であったが，コロナ禍の影響で渡航が不可能となり，Costa教授の研究室の研究者が共同研究として行った．シロイヌナズナの気孔においてCa変動が生じる原因となる気孔の原形質膜で機能するKチャネルの阻害剤の同定を行った．Mock処理と比較して，Ca変動は小さくなる結果が得られた．このことは，細胞内伝達系に阻害剤の影響が生じたことを示す．また，この化合物を，Ｋチャネルを卵母細胞において発現させて電気生理学測定を行い，阻害度合いの結果を取得した．
イオン輸送体調節因子と考えられるCBLとCIPKのそれぞれのプラスミドを酵母に発現させるために，Kチャネルをリン酸化修飾する可能性のある10種類のCBL遺伝子と26種類のCIPK遺伝子を酵母に導入した．２種類のプラスミドを共発現させることによる酵母の負荷は大きい傾向があり，80%程度の数の形質転換酵母が獲得されたが，残りは得られていない．現在繰り返し作業を行っており，目標数に近づけたところでCaシグナルの研究材料として利用する．さらに，この酵母に，３つめのイオン輸送体プラスミドを導入した．今後，形質転換した酵母を用いたアッセイを行う．
上記フラボノイド系化合物の側鎖を置換した類縁体を購入して，イオン輸送体活性の影響を電気生理学的手法により検討した．この類縁体は，基にした化合物よりも阻害効果は比較的小さいことが分かった．現在，他の種類の阻害剤の検討を開始しており，単純化，強力化した化合物の取得をすすめる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
孔辺細胞におけるカルシウム上昇が阻害剤で抑制されたことは意外な結果であった．カルシウムの振動数およびカルシウム上昇度合いが，セカンドメッセンジャーとしての機能の本質と考えられている．今回，Ca振動度合いと振動回数が阻害剤で減少した点は，この阻害剤が孔辺細胞の気孔閉鎖に直接関与することを強く示唆している．今後，この発見を深く掘り下げることにより，これまでわかっていないシグナル分子の役割とシグナル伝達経路を解析していく予定である．この阻害剤は2種類存在しており，両方とも同様の効果を示したことから，この2種類が持つ共通構造がイオン輸送体およびそれ以降のシグナル伝達に影響を与えることが予測された．またCBLおよび CIPKの酵母への遺伝子導入においては,予想された通り形質転換酵母が得られないものが存在した.これはテクニカルな面も考えられるものの,機能分子であるCBLおよびCIPKが酵母において何らかの機能を果たしてしまい,その機能が酵母の増殖を阻害したことが大きいと考えられる.プラスミド導入作業は続けるが，共発現が許されない遺伝子と見極める必要がある．これまで獲得できた形質転換酵母は200種類以上あることからイオン輸送系の制御についてさらに検討する．
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| Strategy for Future Research Activity |
阻害剤によって得られた非常に小さなカルシウムの上昇率の影響を調べるために植物を用いて気孔開度を測定する．葉の上皮の気孔を用いて気孔開度の調節について気孔開度を調節する植物ホルモンを添加して，気孔開度の変化を調べる．明暗によって気孔開度が変化することから，明暗条件における本阻害剤の添加の有無による気孔開度の度合いを調べる．
CBLとCIPKのプラスミドの導入を行いこれまで獲得できていない形質転換酵母の獲得をめざす．またイオン輸送体遺伝子を導入し，酵母の変異を相補する表現型を示す酵母の取得を行う．相補株が取得できた場合はその遺伝子を，別の酵母に導入し確認を行う．再確認を行った遺伝子のタンパク質一次構造と植物における遺伝子発現情報を比較して，生体内における相互作用の可能性を検討する．
前年度に獲得したイオン輸送体阻害剤の類縁体を電気生理学的測定によって阻害活性を調べる．有機合成された類縁体についても同様に測定をすすめる．阻害効果の高い化合物と低い化合物について構造活性相関を予測し，阻害活性の強い類縁化合物について，阻害濃度などの詳細を測定する，またイオン輸送体の種類に応じた阻害活性を検討する．
気孔に発現して気孔の開口と閉鎖を調節するイオン輸送体を対象にした制御化合物による気孔開度への影響の検討をすすめる．明所および暗所など環境条件に依存した植物の気孔開度の変化を電気伝導度測定によって検討する．
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Research Products
(1 results)
