2020 Fiscal Year Research-status Report
On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes
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20KK0157
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森山 賢治 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (00250217)
井口 智弘 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (10783516)
加納 豊 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (90450593)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2025-03-31
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| Keywords | Rif1 / オリゴマー / グアニン４重鎖 / クライオ電顕 / 単粒子解析 / クロマチンループ / テロメア / シェルタリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グアニン四重鎖 (G4)DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1(2,418アミノ酸)、及び分裂酵母Rif1(1,400アミノ酸)の大量精製に着手した。しかし、両者とも、全長タンパク質として高度に大量精製する事は困難であった。マウス全長Rif1は、動物細胞で組換え体として発現し、純度の高い標品を少量得る事ができた。これをHuilinLi教授に解析をしていただき、G4を加える事により構造が安定化する事がわかった。又、マウスRif1について、N末端領域とC末端領域の間にある長い天然変性領域(968アミノ酸)を欠失したRif1-NCを動物細胞から組換え体として大量精製し、解析した。Rif1-NCはオリゴマーであることが確認されたが、分子形態の確定には至らなかった。一方、分裂酵母のRif1の全長精製標品には、除去しにくい分解産物が混在した。しかし、最近、N末端92アミノ酸を欠失した分裂酵母Rif1を発現させるとその問題が軽減することを見出し、現在大量精製を試みている。分裂酵母のC末領域は、G4結合能と多量体形成能を有する。C末領域由来の異なる長さのポリペプチドを組換え体として発現し、大量精製した。更に、G4構造結合と多量体形成のそれぞれが選択的に消失したC末領域点変異体を新たに遺伝学的に同定し、それらのポリペプチドも大量精製した。SEC-MALSによる絶対分子量を測定した結果、４量体を形成している事が示唆された。また構造予測から、C末はcoiled-coil構造をとる事が予測された。実際にcoiled-coil形成に関与すると思われる残基に変異を入れるとG4結合、多量体形成量能が減弱した。現在精製したポリペプチドのX線結晶構造解析を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
「研究実績の概要」に記したように、マウスRif1も分裂酵母Rif1も、全長タンパク質として高純度のタンパクを大量精製することを試みてきたが、分解夾雑物の除去、発現レベルの問題などで、やや困難に直面した。このため、構造解析の研究の進捗が遅れている。全長Rif1の加えて、マウスRif1-NCオリゴマーの精製も、試みた。こちらは全長より、精製が行いやすいが、十分な発現レベルを獲得するための条件検討が必要であった。また、最初に電顕解析に供したのはRif1-NCを発現させた293T細胞の高塩濃度抽出液から精製したものであったが、このRif1-NC標品には不定形凝集体が多かったため、凝集していないRif1-NCの精製を目指した。Rif1-NCは低塩濃度では細胞から抽出され難いため、それまでは高塩濃度抽出液から精製してきたが、低塩濃度抽出液から精製すれば凝集しないのではないかと期待し、低塩濃度抽出液と高塩濃度抽出液の双方からRif1-NCを精製し直した。しかしながら、Li 教授のラボによる電顕観察の結果、どちらのRif1-NCもオリゴマーのようには見えるが、正確に何量体なのかは断定できず、分子形態の確定に至らなかった。また、分裂酵母Rif1については、全長を発現させるとN末端とC末端を両方含む分解産物（除去困難）が蓄積するという問題を解決するのに時間を要した。また、コロナ禍で、相手先を訪問することができず、計画通りに研究を遂行できなかった。このような複数の事情で研究全体の進捗にやや遅れが見られる。
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| Strategy for Future Research Activity |
精製したマウス全長Rif1あるいは、Rif1-NCオリゴマーの分子形態の確定には至っていないが、G4オリゴヌクレオチドDNAを結合することにより形態が安定化することを見出し、G4オリゴヌクレオチドと全長およびRif1-NC の複合体の電顕観察を実施する。Rif1NCについては、大量精製が可能であり、現在大量精製を行なっている。全長についても、大量精製は困難であるが、発現効率を増加させるための条件検討を行なっており、少量でも純度の高い標品の精製を目指す。マウスRif1-NC やN末端92アミノ酸を欠失した分裂酵母Rif1だけでなく、今後”On-grid biochemistry”解析に必要となるテロメア複合体（シェルタリン）構成タンパク質等を限られた労力で十分に精製するためには、発現用細胞でのトランスフェクション効率／発現効率を大幅に向上させる必要がある。そのため、細胞やトランスフェクション試薬／条件の最適化を図るとともに、発現タンパク質のN末端側に付加するタグを発現増強効果が見込まれる種々のタグに変更して強制発現させる。また、電顕解析に供するタンパク質は、研究員と学生１名が主に担当していたが、細胞の調製など技術員や学生の協力を得て、研究を加速させ、一日も早くRif1とG4との結合様式を解明する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍で、実験遂行に大きな障害が出たため、解析に必要なタンパク質の大量精製のための実験を予定通り 遂行できなかった。また、渡航もできなかったので、相手側研究施設における構造解析のための実験も遂行できなかった。このため共同研究に遅れが生じ、次年度使用額が生じた。
次年度使用計画は下記の通りである。
タンパク質大量精製のために必要な血清、培地、タンパク精製のためのレジン、タンパク精製に必要な試薬、結晶化の条件を決定するためのキットなどの購入。
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[Journal Article] LDL-mimetic lipid nanoparticles prepared by surface KAT ligation for in vivo MRI of atherosclerosis2020
Author(s)
Fracassi A, Cao J, Yoshizawa-Sugata N, Toth E, Archer C, Groninger O, Ricciotti E, S-Y Tang, Handschin S, Bourgeois J-P, Ray A, Liosi K, Oriana S, Stark W, Masai H, Zhou R, Yamakoshi Y
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Journal Title
Chem Sci
Volume: －
Pages: －
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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