2023 Fiscal Year Research-status Report
On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes
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20KK0157
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森山 賢治 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (00250217)
井口 智弘 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (10783516)
加納 豊 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (90450593)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2025-03-31
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| Keywords | Rif1 / オリゴマー / グアニン四重鎖 / 電子顕微鏡 / 単粒子解析 / クロマチンループ / テロメア / シェルタリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初、G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）及び分裂酵母Rif1（1,400アミノ酸）の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。
そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC末端領域（CTD, 299アミノ酸）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。
N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。また。LLPSに関与するアミノ酸を同定したので、その変異体のタンパク調製を行っている。分裂酵母およびヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー（四量体）を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。また、Li博士を訪問し、構造解析についての詳細な打ち合わせを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
「研究実績の概要」に記したように、マウスRif1も分裂酵母Rif1も、全長タンパク質として高度に大量精製することは非常に困難であり、これが研究の進捗が遅れた主な要因である。また、内在的な不安定性を有しており、分解産物を除去するのが困難であったことも進歩を遅らせた要因である。また、精製できたタンパク質も電子顕微鏡解析の結果、average画像を作るのが困難であった。おそらく、一部形態に可動性があることが原因であろうと考えた。我々は、C末領域にLLPS形成配列があることを発見し、これが一定の構造を作らないことの原因であろうと考えた。今年度、LLPSを形成しない変異体を、全長およびC末ポリペプチドで作製した。高速AFMの解析から、NTDおよびCTDはダイナミックにその位置関係を変化させていることが明らかになった。さらにG4の存在下では、CTDが分断化されることが明らかとなった。このことはG4結合によりC末が単量体に変換されることを示唆した。
これらのタンパクを用いクライオ電顕による観察を継続するとともに、Rif1C末ポリペプチドを大腸菌から大量精製し、結晶化・構造解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 現在ヒト全長Rif1、Rif1-及び、その変異体を作製しその大量精製を進めている。これらのタンパク質が十分に精製でき次第、電顕観察・単粒子解析に供する。2) また、N末端92アミノ酸を欠失した分裂酵母Rif1、及び、そのC末端のテトラマー形成ドメインについては、Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進め、また、九州大学の神田大輔教授と共同で結晶化、X線構造解析を進める。3) Rif1の分子動態は、その核内染色体構造の制御と大きく関連すると思われる。高速AFMによるRif1のダイナミクスの解析をG4 DNAやリン脂質の存在下で行う。4) IDP領域はリン酸化など種々の修飾を受ける。これらの修飾が分子動態に与える影響を高速AFM観察で明らかにする。5) G4結合が、C末ポリペプチドの多量体形成を阻害し、脂質への結合を促進するメカニズムを解明する。6) IDP領域を欠損するRif1変異株を樹立し、その複製タイミングや染色体高次構造(HiC)に及ぼす影響を解析する。7) Li 教授を訪問し、構造解析の成果の論文化について議論する。
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| Causes of Carryover |
2500アミノ酸におよぶサイズの大きいRif1タンパク質は、増産の効率、分解などの問題のため、解析に適した精製度を有するタンパク質を十分量得ることが難しかった。また、Li 教授を訪問する日程調整が予定通りに進まず訪問期間が短くなった。
今後、さらに全長Rif1も含めて種々の変異体を作製して、それらを大量精製するために、組換えDNAのための試薬、DNA精製のキット、 血清、培地、タンパク精製のためのレジンなどの購入に充てる。また、Li博士を再度訪問し、構造解析の実験を遂行する。そのための旅費、滞在費にも充てる。
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Research Products
(33 results)
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[Presentation] Association of Rif1 with nuclear membrane is essential for genome-wide replication timing regulation2023
Author(s)
Tomohiro Iguchi, Sayuri Ito, Naoko Kakusho, Rino Fukatsu, Kenji Moriyama, Asako Sawano, Asami Oji, Mikihiro Shibata, Atsushi Miyawaki, Ichiro Hiratani, Hiroyuki Sasanuma and Hisao Masai
Organizer
CSHL Meeting 2023 on Eukaryotic DNA Replication & Genome Maintenance
Int'l Joint Research / Invited
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