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2023 Fiscal Year Research-status Report

On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes

Research Project

Project/Area Number 20KK0157
Research InstitutionTokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Principal Investigator

正井 久雄  公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 森山 賢治  公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (00250217)
井口 智弘  公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (10783516)
加納 豊  公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (90450593)
Project Period (FY) 2020-10-27 – 2025-03-31
KeywordsRif1 / オリゴマー / グアニン四重鎖 / 電子顕微鏡 / 単粒子解析 / クロマチンループ / テロメア / シェルタリン
Outline of Annual Research Achievements

当初、G4(グアニン四重鎖)DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1(2,418アミノ酸)及び分裂酵母Rif1(1,400アミノ酸)の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。
そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域(NTD, 1,151アミノ酸)とC末端領域(CTD, 299アミノ酸)の間にある長い天然変性領域(LID, 968アミノ酸)を欠失させたRif1-NC(NTD+CTD)を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。
N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。また。LLPSに関与するアミノ酸を同定したので、その変異体のタンパク調製を行っている。分裂酵母およびヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー(四量体)を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。また、Li博士を訪問し、構造解析についての詳細な打ち合わせを行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

「研究実績の概要」に記したように、マウスRif1も分裂酵母Rif1も、全長タンパク質として高度に大量精製することは非常に困難であり、これが研究の進捗が遅れた主な要因である。また、内在的な不安定性を有しており、分解産物を除去するのが困難であったことも進歩を遅らせた要因である。また、精製できたタンパク質も電子顕微鏡解析の結果、average画像を作るのが困難であった。おそらく、一部形態に可動性があることが原因であろうと考えた。我々は、C末領域にLLPS形成配列があることを発見し、これが一定の構造を作らないことの原因であろうと考えた。今年度、LLPSを形成しない変異体を、全長およびC末ポリペプチドで作製した。高速AFMの解析から、NTDおよびCTDはダイナミックにその位置関係を変化させていることが明らかになった。さらにG4の存在下では、CTDが分断化されることが明らかとなった。このことはG4結合によりC末が単量体に変換されることを示唆した。
これらのタンパクを用いクライオ電顕による観察を継続するとともに、Rif1C末ポリペプチドを大腸菌から大量精製し、結晶化・構造解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

1) 現在ヒト全長Rif1、Rif1-及び、その変異体を作製しその大量精製を進めている。これらのタンパク質が十分に精製でき次第、電顕観察・単粒子解析に供する。2) また、N末端92アミノ酸を欠失した分裂酵母Rif1、及び、そのC末端のテトラマー形成ドメインについては、Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進め、また、九州大学の神田大輔教授と共同で結晶化、X線構造解析を進める。3) Rif1の分子動態は、その核内染色体構造の制御と大きく関連すると思われる。高速AFMによるRif1のダイナミクスの解析をG4 DNAやリン脂質の存在下で行う。4) IDP領域はリン酸化など種々の修飾を受ける。これらの修飾が分子動態に与える影響を高速AFM観察で明らかにする。5) G4結合が、C末ポリペプチドの多量体形成を阻害し、脂質への結合を促進するメカニズムを解明する。6) IDP領域を欠損するRif1変異株を樹立し、その複製タイミングや染色体高次構造(HiC)に及ぼす影響を解析する。7) Li 教授を訪問し、構造解析の成果の論文化について議論する。

Causes of Carryover

2500アミノ酸におよぶサイズの大きいRif1タンパク質は、増産の効率、分解などの問題のため、解析に適した精製度を有するタンパク質を十分量得ることが難しかった。また、Li 教授を訪問する日程調整が予定通りに進まず訪問期間が短くなった。
今後、さらに全長Rif1も含めて種々の変異体を作製して、それらを大量精製するために、組換えDNAのための試薬、DNA精製のキット、 血清、培地、タンパク精製のためのレジンなどの購入に充てる。また、Li博士を再度訪問し、構造解析の実験を遂行する。そのための旅費、滞在費にも充てる。

  • Research Products

    (33 results)

All 2024 2023 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (8 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 8 results,  Open Access: 8 results) Presentation (23 results) (of which Int'l Joint Research: 10 results,  Invited: 11 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] Van Andel Research Institute(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      Van Andel Research Institute
  • [Journal Article] Phosphorylation inhibits intramolecular interactions, DNA-binding and protein interactions of Claspin through disordered/ structured conformation transition2024

    • Author(s)
      You Zhiying、Hsiao Hao-Wen、Yang Chi-Chun、Goto Hidemasa、Masai Hisao
    • Journal Title

      bioRxiv

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1101/2024.01.08.574761

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Homology recognition without double-stranded DNA-strand separation in D-loop formation by RecA2024

    • Author(s)
      Shibata Takehiko、Ikawa Shukuko、Iwasaki Wakana、Sasanuma Hiroyuki、Masai Hisao、Hirota Kouji
    • Journal Title

      Nucleic Acids Research

      Volume: 52 Pages: 2565~2577

    • DOI

      10.1093/nar/gkad1260

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Homologous recombination contributes to the repair of acetaldehyde-induced DNA damage2024

    • Author(s)
      Yamazaki Kosuke、Iguchi Tomohiro、Kanoh Yutaka、Takayasu Kazuto、Ngo Trinh Thi To、Onuki Ayaka、Kawaji Hideya、Oshima Shunji、Kanda Tomomasa、Masai Hisao、Sasanuma Hiroyuki
    • Journal Title

      Cell Cycle

      Volume: 3 Pages: 1~16

    • DOI

      10.1080/15384101.2024.2335028

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Histone Modification Analysis of Low-Mappability Regions2023

    • Author(s)
      Yoshizawa-Sugata Naoko、Masai Hisao
    • Journal Title

      Methods Mol Biol .

      Volume: 19 Pages: 163~185

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-2433-3_18

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Water-Soluble Gd(III)-Porphyrin Complexes Capable of Both Photosensitization and Relaxation Enhancement2023

    • Author(s)
      Nemeth Tamas、Yoshizawa-Sugata Naoko、Pallier Agnes、Tajima Youichi、Ma Yue、Toth Eva、Masai Hisao、Yamakoshi Yoko
    • Journal Title

      Chemical Biomedical Imaging

      Volume: 1 Pages: 157~167

    • DOI

      10.1021/cbmi.3c00007

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Cdc7 kinase is required for postnatal brain development2023

    • Author(s)
      Hori Karin、Yamazaki Satoshi、Ohtaka‐Maruyama Chiaki、Ono Tomio、Iguchi Tomohiro、Masai Hisao
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: 28 Pages: 679~693

    • DOI

      10.1111/gtc.13059

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Cell fusion upregulates PD-L1 expression for evasion from immunosurveillance2023

    • Author(s)
      Tajima Youichi、Shibasaki Futoshi、Masai Hisao
    • Journal Title

      Cancer Gene Therapy

      Volume: 31 Pages: 158~173

    • DOI

      10.1038/s41417-023-00693-0

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Catalytic domain-dependent and -independent transcriptional activities of the tumour suppressor histone H3K27 demethylase UTX/KDM6A in specific cancer types2023

    • Author(s)
      Sun Wendi、Lee Kian Leong、Poellinger Lorenz、Masai Hisao、Kato Hiroyuki
    • Journal Title

      Epigenetics

      Volume: 18 Pages: 2222245

    • DOI

      10.1080/15592294.2023.2222245

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Regulation of replication timing and nuclear localization of chromatin by Fission yeast Rif1 protein2023

    • Author(s)
      Hisao Masai, Yutaka Kanoh, Daisuke Kohda, Tomoko Sagi
    • Organizer
      11th International Fission Yeast Meeting POMBE 2023
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] From DNA replication to G-quadruplex: my long journey on science with my mentor, Ken-ichi Arai2023

    • Author(s)
      Hisao Masai
    • Organizer
      Cold Spring Harbor Asia meeting on The Now and Future of RNA Therapeutics
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Association of Rif1 with nuclear membrane is essential for genome-wide replication timing regulation2023

    • Author(s)
      Tomohiro Iguchi, Sayuri Ito, Naoko Kakusho, Rino Fukatsu, Kenji Moriyama, Asako Sawano, Asami Oji, Mikihiro Shibata, Atsushi Miyawaki, Ichiro Hiratani, Hiroyuki Sasanuma and Hisao Masai
    • Organizer
      CSHL Meeting 2023 on Eukaryotic DNA Replication & Genome Maintenance
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] G4 binding and oligomerization activities of fission yeast Rif1protein are required for long-range regulation of origin firing.2023

    • Author(s)
      H. Masai, Y. Kanoh, D. Kohda, T. Sagi
    • Organizer
      Cold Spring Harbor Asia Conference on YEAST AND LIFE SCIENCES
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Transcription can drive DNA replication2023

    • Author(s)
      Hisao Masai
    • Organizer
      70 Years of DNA Double Helix: Celebration of Breakthroughs in Life Science
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Regulation of replication timing and DNA repair by nuclear membrane tethering of Rif12023

    • Author(s)
      Hisao Masai, Tomohiro Iguchi, Sayuri Ito, Mikihiro Shibata, Naoko Kakusho, Rino Fukatsu, Asami Oji, Ichiro Hiratani, Hiroyuki Sasanuma
    • Organizer
      The 14th International Symposium on DNA Damage Response & Human Disease
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Biological functions of G-quadruplexes in regulation of DNA replication2023

    • Author(s)
      Hisao Masai
    • Organizer
      50th International Symposium on Nucleic Acid Chemistry
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Analysis of Rif1 C-terminal function for chromatin higher order structure.2023

    • Author(s)
      Yutaka Kanoh, Kaho Takasawa, Seiji Matsumoto, Hisao Masai
    • Organizer
      The 11th International Fission Yeast Meeting
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Neural stem cell- or Hematopoietic stem cell-specific knockout of Cdc7 or ASK(Dbf4) causes common and distinct phenotypes2023

    • Author(s)
      Tomohiro Iguchi, Karin Hori, Satoshi Yamazaki, Rie Ishii, Hiroyuki Sasanuma, Hisao Masai, Iguchi, T.
    • Organizer
      Cold Spring Harbor Laboratory Meeting
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Oligomerization of Rif1 is essential for its ability to suppresses replication over a long distance S. Pombe.2023

    • Author(s)
      Yutaka Kanoh, Kaho Takasawa, Seiji Matsumoto, Hisao Masai
    • Organizer
      Cold Spring Harbor Asia Conference, YEAST AND LIFE SCIENCES
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 染色体DNA複製開始複合体と開始制御メカニズムの新たな展望2023

    • Author(s)
      Hisao Masai, Taku Tanaka, Tomohiro Iguchi, Sayuri Ito, Naoko Kakusho, Rino Fukatsu, Yutaka Kanoh, Tomoko Sagi, and Hiroyuki Sasanuma
    • Organizer
      第96回日本生化学会大会
    • Invited
  • [Presentation] 染色体動態・維持・機能を決定する多様な因子2023

    • Author(s)
      井口 智弘、伊藤 さゆり、覺正 直子、深津 理乃、森山 賢治、坂上-沢野 朝子、大字 亜沙美、柴田 幹大、宮脇 敦史、平谷 伊智朗、笹沼 博之、正井 久雄
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
    • Invited
  • [Presentation] 転写に依存するmulti-replicon 様式の大腸菌染色体複製とG4形成の役割2023

    • Author(s)
      田中 卓、鷺 朋子、深津 理乃、覺正 直子、正井 久雄
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
    • Invited
  • [Presentation] Rifの欠失は特異なエンハンサー構造を形成し、初期胚での胚ゲノム活性化と連動する2023

    • Author(s)
      吉沢 直子、正井 久雄
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
    • Invited
  • [Presentation] Oligomerization of Rif1 is essential for its ability to suppresses replication over a long distance S. Pombe.2023

    • Author(s)
      Yutaka Kanoh, Kaho Takasawa, Seiji Matsumoto, Hisao Masai
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] Investigation of the contribution of type 2 Topoisomerase-dependent DNA breaks to cancer development2023

    • Author(s)
      Trinh Ngo, Hisao Masai, Hiroyuki Sasanuma
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] Functions associated with the long IDP segment of Rif1, a regulator of replication timing, DSB repair and chromatin architecture2023

    • Author(s)
      Bingyi Li, Kosuke Yamazaki, Tomohiro Iguchi, Hiroyuki Sasanuma, Hisao Masai
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] Cell fusion upregulates PD-L1 expression and promotes tumor formation.2023

    • Author(s)
      Youichi Tajima, Hisao Masai
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] Rif1の細胞周期依存的なマルチオミクス解析2023

    • Author(s)
      山﨑 航輔、冨田 拓哉、佐伯 泰、正井 久雄、笹沼 博之
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] マウスのCD4+T細胞における転写制御と分化におけるClaspinの役割2023

    • Author(s)
      蕭 皓文、井口 智弘 、笹沼 博之、正井 久雄
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] ClaspinのN末端リン酸化による複製ストレス活性化、分子内相互作用、DNA結合の制御2023

    • Author(s)
      Zhiying You, Chi-Chun Yang, Hisao Masai
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] グアニン四重鎖特異的なタンパク質リクルート法の開発2023

    • Author(s)
      指田 万奈帆、長澤 和夫、寺 正行、笹沼 博之、正井 久雄
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Presentation] グアニン四重鎖-タンパク質間を連結するリガンドの合成2023

    • Author(s)
      指田 万奈帆、笹沼 博之、正井 久雄、長澤 和夫、寺 正行
    • Organizer
      日本ケミカルバイオロジー学会 第17回年会
  • [Remarks] ゲノム動態プロジェクト

    • URL

      https://www.igakuken.or.jp/genome/

URL: 

Published: 2024-12-25  

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