2020 Fiscal Year Research-status Report
細胞シート工学を用いたラミノパチー疾患モデル構築と核ラミナ修復機構の解明
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20KK0158
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
志見 剛 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 特任准教授 (60817568)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 洋平 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 研究員 (20831697)
木村 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (30241392)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2025-03-31
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| Keywords | 核ラミナ / ラミン / 核膜孔複合体 / ヌクレオポリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画に従って、研究代表者である志見と研究分担者である東京工業大学の河野は、DNAプラスミドの作製と細胞株の樹立を行っている。核膜の破損部に集積したラミンが形成する構造を調べるために、核膜の破損マーカーであるmCherryと融合したNLS（mCherry-NLS）と共にmEmeraldと融合したA型とB型ラミンを発現させた野生型のマウス胎児線維芽細胞（MEF）の核膜をレーザー照射によって破損し、共焦点レーザー走査顕微鏡によって生細胞観察を行った。その結果、A型ラミンだけが破損した核膜に集積することが判明した。次に、破損した核膜の修復に必要なA型ラミンを同定するために、mCherry-NLSとHaloと融合したDNAセンサーであるcGAS（Halo-cGAS）を発現させた野生型MEF、A型とB型ラミンのノックアウトMEFを用いて同様の実験を行った。A型ラミンのノックアウトMEFでは、核膜の破損部へのHalo-cGASの集積に遅延が観察された。さらに、A型ラミンは、Ig-foldドメインを介してBAFと結合することによって核膜の破損部に集積する可能性を調べるために、BAFをノックダウンして同様の実験を行ったところ、核膜の破損部へのA型ラミンの集積は観察できなかった。研究分担者である東京工業大学の木村は、核膜の破損に伴って引き起こされるDNA損傷を生細胞で観察するために、Gamma-H2AXに特異的に結合するMintbodyの開発とFabLEMの提供を行っている。これまでに、生細胞におけるFabLEMを用いたGamma-H2AXの可視化に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究計画によれば、ノースウエスタン大学（米国）のGoldman博士の研究室に出向いて3D-SIMを用いた実験を行い、核膜の破損部における核ラミナ、核膜孔複合体、クロマチンの微細構造を解像する予定であった。しかし、コロナウイルス感染の拡大によって、渡米して現地に4ヶ月間滞在することは困難な状況が続いている。国内で志見、河野、木村が行う実験材料の作製と顕微鏡観察は、研究計画に従って順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
コロナウイルス感染の拡大によって、ノースウエスタン大学（米国）のGoldman博士との共同研究を行うために渡米して現地に4ヶ月間滞在することは困難な状況が続いている。今年度（2021年度）の後半にコロナウイルス感染の拡大が収束すれば、研究計画に従って渡米して実験を行う予定である。もしコロナウイルス感染が再拡大すれば、予定を変更して来年度（2022年度）に渡米して実験を行うことにする。
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| Causes of Carryover |
実験に必要なDNAプラスミドと細胞株が不足している。よって、次年度使用額は、前年度（2020年度）に行ったDNAプラスミドの作製と細胞株の樹立を継続するために必要な試薬等の費用として計上する。
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